浅谈蛋白质的亚细胞定位的研究方法
关于研究蛋白质细胞定位的几种方法
幼儿园大班教师个人工作总结姓名：甄萍萍导师：梁建生
真核细胞具有复杂的亚细胞结构，已发现数十种细胞器，每种细胞器都有一组特定的蛋白。真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或粗糙内质网合成，最终运送到不同地点，形成成熟蛋白并行使功能。译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋白在胞内定位。蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中心问题，也是分子生物学研究的热门话题。了解某些蛋白质的定位从而分析探索其生物学功能，意义重大。目前，这方面的工作己取得很大进展。细胞器不同，相应的靶向蛋白的定位过程也不同。
研究蛋白的亚细胞定位可采取多种方法：免疫胶体金标记；免疫荧光；与gfp构建融合基因，用荧光显微镜观察；蔗糖密度梯度离心；多糖序列分析等。以下介绍免疫胶体金标记、免疫荧光、与gfp构建融合基因等常用方法。
1 免疫胶体金标记
金标法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫电镜。当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红，不需加外进行染。在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰
可辨。因此，免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物学的各个方面，并取得了可喜的进展。胶体金是由氯金酸（HAuCL4）在还原剂如白磷、抗坏血酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。夸河套歌词
免疫胶体金标记电镜技术广泛应用于细胞及组织内蛋白的定位研究，是利用胶体金在碱性环境中带负电的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记。电镜水平的免疫金染是目前较理想的免疫定位方法，具有特异性强、灵敏度高、定位准确和具有双重标记功能等优点。例如用连有15nm金颗粒的GFP单克隆抗体以及连有lOnm金颗粒的过氧物酶体的标志酶抗体作为一抗进行免役金标，证明CAT1-GFP定位在过氧物酶体(Akane Kamigaki eta1.,2003)。
淘宝人生成就2 免疫荧光
根据抗原与抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原或抗体复合物上含有各种颜的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激光的照射而发出各种颜的荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。
用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。
S. pagny等(2003)将XYIT36: GFP转入拟南芥，检测发现荧光出现在高尔基体。使用植物Lewis(高尔基体标志分子)抗体以及BIP(内质网标志分子)抗体进行免疫荧光标记，发现GFP的绿荧光与使用Lewis抗体所做的免疫荧光存在共定位，而与BIP分布在不同部位。说明XYIT36: GFP定位在高尔基体。
3 GFP及其在生命科学研究中的应用
3.1 简介GFP
海洋生物发光是个非常普遍的现象。从原生生物到脊椎动物均有生物发光，如海萤，磷虾，腔肠动物等。从不同动物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同，不同动物荧光发生机制有很大差别。多管水母体内存在两种发光蛋白绿荧光蛋白:GFP和aequorin。当aequorin与3个Ca2+结合后，即发生氧化反应并发射蓝光，最大发射波长469nm。 GFP被紫外光或蓝光激发后发出绿荧光。发光机制如下:
GFP在水母体内的发光机制
crv是什么GFP由gfp基因编码，具有238个氨基酸残基的多肽单体，分子量约27kD。GFP有两个吸收峰，最大吸收峰在395nm，在475nm还有一个吸收峰，前者由紫外光激发，后者由蓝光激发。发射光谱也有两个峰值:509nm和540nm，呈绿或黄绿荧光。
GFP荧光的产生主要归功于分子内第65, 66, 67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生团的功效。翻译出的蛋白折叠环化后，在O
存在下分子内第67位甘氨酸的酰基对第65位
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丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的。a-β键脱氢反应之后，导致芳香
团与咪唑基结合。这样GFP分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生团，该过程可自动催化合成。GFP晶体结构(如图)显示，蛋白中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中心a螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成是从这个螺旋开始，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由1个短的垂直片段覆盖，生团位于大空腔内。
GFP的晶体结构
3.2 GFP在生命科学研究中的应用省委办公厅
GFP虽能自发荧光，但野生型GFP荧光较弱。为了改善GFP荧光特性，对GFP进行了突
变和重组实验。某些突变使GFP明显地改变激发和释放波谱，或增加GFP的可溶性或表达量。Pang等获得的GFP突变型比野生型亮度增强20倍;Tian等发现野生型GFP是低水平表达，而改良后的GFP表达
量增加100倍。Cormack等获得的三位点替代突变体的荧光强度比野生型高100倍，而且在自然光下就能观察到绿荧光，使得gfp作为报告基因更为灵敏和迅速。Confocal能有效消除同一焦平面上非检测点的杂散荧光和非焦平面荧光的干扰，使分辨率提高，获得清晰图象，而且它具有逐层扫描功能，可对组织细胞进行无损伤的系列光学切片。Confocal的应用更有利于GFP在生物学研究中的应用。
应用DNA亚克隆技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因、显微注射、电激转化等方法转化合适的细胞，利用目的基因的基因表达调控机制，如启动子和信号序列来控制融合基因的表达，在荧光显微观察系统下监测融合蛋白在细胞内的存在状态（王关林等，1998）。
3.2.1细胞器研究
在植物发育过程中可以利用GFP直接观察生活细胞中线粒体的数目、分配和运动。将GFP与某一导肽序列融合可将GFP定位到特定的细胞器和膜系统中，然后对其进行活体观察来研究不同细胞器的动态、功能以及内膜系统。如将GFP和内质网定位信号KDEL构建成融合蛋白，结果在转化细胞的内质网中观察到膜皮层样的网状结构(Scotta, Wyatts, 1999)。此标记物也促进了内膜系统结构、功能和囊泡运输的研究。还可用GFP的光谱突变体如蓝荧光蛋白、青荧光蛋白、黄荧光蛋白来研究不同植物细胞骨架组分之间的相互作用，如微管和肌动蛋白相互作用的研究。
3.2.2 蛋白质研究
将GFP作为荧光探针，与要研究的蛋白质融合在一起，进行活细胞内蛋白质的分布与变化研究。此方法在过去几年中对细胞生物学的观察有着显著影响。水稻的CaM类蛋白OsCaM61，含有N一端CaM区域，C端有异戊二烯化位点。将OsCaM61与GFP融合起来，研究其亚细胞定位，发现GFP- OsCaM61融合蛋白是膜结合的，而OsCaM61-GFP却主要在核质。用mevinolin处理细胞，阻止类异戊二烯合成，引起GFP- OsCaM61运输到核质。前者C端的异戊二烯化位点被掩盖而后者的位点是活跃的。此蛋白的异戊二烯化状态对于细胞定位起决定性作用。亚细胞定位依赖于蛋白的异戊二烯化状态，表明在不同的生理条件下，这种类CaM可能通过结合到定位于不同细胞成分的靶子上，起到不同的功能作用(Akane Kamigaki etal.，2003)。
用GFP还可以用于基因沉默、启动子活性、细胞信号转导和细胞局部区域的pH、内生菌和植物相互作用研究等。GFP在动物学研究方面的应用也非常广泛(比如用于研究肿瘤发生机制、转移机制、基因等)。
gfp用作报告基因有众多优点：1灵敏度高，易检测并且是活体检测，对细胞组织不具破坏性。而当选用gus作报告基因时，在组织学检测时，一定程度上具有破坏性。因为要对材料进行固定，保温和脱，并且植物中存在GUS本底，影响检测的准确性；2在活体内表达不受生物类型、基因型、细胞和组织类型的限制；3不需任何底物和外源辅因子参与；4便于早期筛选转基因材料。
GFP在生物学研究中应用广泛，有很大优越性，但也存在一定的问题。GFP的检测受背景荧光和光漂白现象的限制，它的过量表达对细胞是有毒的，转化细胞再生能力下降。实验
中很难建成GFP稳定细胞株，可能与GFP参与细胞凋亡有关。
参考文献：
1.Akane Kamigaki. Identification of peroxisomal targeting signal of pumpkin
catalase and the binding analysis with PTS1 receotor. Plant Journa1.2003, 33:161-175
2.Scott A, Wyatt S, TsouP L, et al. Model system for plant cell biology; GFP imaging
in living onion epidermal cells. Biotechniques, 1999, 26: 1125-1132
3.S.Pagny. Structural reguirements for Arabidopsis f31,2-xylosyltransferase
射箭高手activity and targeting to the Golgi. Plant Journal, 2003, 33:189-203
4.王关林，方宏绮.植物基因工程原理与技术.北京：科学出版社，1998.

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