纸层析法实验步骤
前言
纸层析法 纸层析法又称纸谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离（rf值）与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比法等）。
纸层析法（paper chromatography）就是生物化学上拆分、鉴别氨基酸混合物的常用技术，可以用作蛋白质的氨基酸成分的定性鉴别和定量测定；也就是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种拆分分析工具。纸层析法就是用滤
纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。
在环境分析测试中，有时用纸层析法拆分试样组分，它用作一些精度相对较低的分析，如3，4-苯并芘。但不如gc、hplc应用领域广泛。在
做叶绿体素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿液体，将液体与层析液（石油醚）混合，将滤纸一段进入混合液体，四种素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条素带。由此观查出各种素的相对含量和种类。
纸层析法通常用作叶绿体中素的拆分，叶绿体中素主要包含胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度相同，溶解度小的随层析液在滤纸上蔓延地慢，反之则快；含量较多者素拎也较宽。最后在滤纸上遗留下4条素拎，所以利用纸层析法 能够确切地将叶绿体中的素拆分。
氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，
品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为万吨，而需求总量是万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61％，在饮料工业占30％，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。
氨基酸在人类生活的很多方面都有著应用领域：
(1)在食品行业的应用
(2)在医药工业的应用领域
(3)在饲料添加剂行业的应用
(4)在化妆品行业的应用领域
(5)在农业上的应用
(6)在其他行业的应用领域
氨基酸工业还有着广阔的发展前景：
(1)传统的氨基酸生产方法
(2)运用基因工程手段生产氨基酸
(3)大力发展药用中间体,具体内容为：
①氨基酸及其衍生物逐渐成为药用中间体
②非天然氨基酸就是制备活物的关键原料
③生产高附加值的非天然氨基酸
一、实验目的
(1)掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术（包括点样、平衡、展层、显）。
(2)自学未明样品的氨基酸成分（水解、层析及鉴别）分析的方法。
二、实验原理
(1)纸层析就是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具备亲水性，溶解一层水做为紧固二者，有机溶剂为流动二者。当有机二者穿过紧固相时，物质在两相间不断分配而获得拆分。
(2)溶质在滤纸上的移动速度用比移值rf值表示。
(3)rf=原点至层析斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离。
(4)在一定的条件下某种物质的rf值是常数。rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。材料与方法
三、实验装置与试剂
(1)氨基酸标准液(1mg/ml)
亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。
(2)80%甲醇
(3)0.1%茚三酮丙酮溶液
(4)氨基酸混合液(每种氨基酸mg/ml)
(5)正丁醇
实验仪器
(1)新华滤纸×1
(2)培养皿×1
(3)电热鼓风干燥箱×1
(4)吹风机×1
(5)毛细管×4
（6）针、线、尺×1
（7）钟罩(低约mm,直径约mm，具磨口塞)×1
实验操作
(1)滤纸
选用国产新华 1号滤纸， 6cm×7cm。在距滤纸2cm处划线，用
铅笔在线上标上四个点做为点样位子（腾出缝线空间）。
（2）点样
点样必须最合适，样品点的太淡，斑点极易蔓延或变长，以致拆分不明。用毛细管汲取氨基酸样品，与滤纸横向方向轻轻触碰点样处的中心，这时样品就自动流入。点样的蔓延直径掌控在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干活后再点第二几滴，为并使样品快速潮湿，需用吹风机揉搓，但必须特别注意温度不容过低，以免氨基酸毁坏，影响定量结果。 将点不好样品的滤纸两侧比齐，用线缝不好，搓成筒状。特别注意缝线处纸的两边不要碰触。防止由于毛细管现象并使溶剂沿两边移动特别慢而导致溶剂前沿不齐，影响rf值。
(3)展层
将搓成圆筒状的滤纸放进培养皿内 (特别注意滤纸不要碰到皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，抽出滤纸，立即用铅笔标示出溶剂前沿边线。
酸溶剂系统：
正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮2ml。温度25℃，时间1h。
注意：使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。
（4）呈
（5）rf值的计算48小时核酸证明需要纸质的吗
实验六 纸层析法观测转回氨基促进作用
【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用
室温：28°
（一）实验目的：
1、自学氨基酸纸层析的基本原理。
2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。
（二）实验原理：
转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（alt）催化如下反应：
本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的发生，以证明转回氨基促进作用。纸层析属分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力弱，水被溶解在滤纸的.纤维素的纤维之间构成紧固二者。有机溶剂与水不相水溶性，把进度表拆分物质提至滤纸的一端，并使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动展开已连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异，而并使移动速度就不一样，在紧固看中，分配趋势很大的组分，随其流动二者移动的速度就慢，反之，在流动二者分配趋势很大的成分，移动速度快，最终相同的组分彼此拆分，物质在纸上移动的速率可以用比值rf则表示： alt
物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用rf值来鉴定被分离的物质。
（三）实验材料与仪器：
试剂：
1、0.01mol/l ph 7.4磷酸盐缓冲液。
2、0.2mol/l na2hpo4溶液81ml与0.2mol/l nah2po4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。
4 、0.1mol/lα－酮戊二酸称取α－酮戊二酸1.克,先溶少量0.01mol/l ph 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 n naoh认真调到ph 7.4 后，提磷酸盐缓冲液至ml。
5、0.1mol/l 谷氨酸溶液称取谷氨酸0.克,先溶于少量0.01mol/lph 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 n naoh仔细调至ph 7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至50 ml。
6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5特在 ml丙酮中熔化。
7、层析溶剂：将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，静置24小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。
仪器：玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液圆柱形。
（四）实验步骤:
1、肝匀浆制取：挑新鲜动物肝0.5克,剪碎后放进匀浆器,重新加入热0.01mol/lph 7.4磷酸盐缓冲液1.0 ml,快速宝芙丽芳匀浆， 用上述缓冲液4.5ml搅匀水泵。
2、 酶促反应过程
（1）挑离心管两支，编号：1（测量管）、2（对照管），各提肝匀浆0. 5ml。把对照管摆沸水浴中冷却10分钟，抽出加热。
（2）各加0.1mol/l丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/lα-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/l ph 7.4磷酸盐缓冲液1.5 ml,摇匀。
（3）37℃保温，30分钟后抽出，保温完。
（4）把测定管放沸水浴中煮10分钟，取出后冷却，过滤。
3、层析
（1）取圆形滤纸一张（直径9cm）放洁白纸上，以圆点为中心，约1 cm为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。
（2）点样：用四根毛细玻璃管分别展开点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点2、4处为。把测量液、对照液分别点在原点1、3处为。特别注意斑点不必过小（应当在直径0.5cm以下）。在第一次点样点干活后，再在原处同样点第2次。
（3）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。
（4）把滤纸平放到上述培养皿上，并使纸芯下灌入层析液中，砌上培养皿砌。可知层析液沿纸芯下降至滤纸中心，渐向四周蔓延。当层析液前缘至距滤纸边缘约1cm时，约25分钟，抽出滤纸，用镊子小心摘下纸芯，放进烘箱中研磨。
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