干燥方式对pH改性豌豆分离蛋白功能性和结构的影响
干燥方式对 pH 改性豌豆分离蛋白
功能性和结构的影响
李开放，蒋
将，刘元法
( 江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)
摘要: 以豌豆为原料制备豌豆分离蛋白( PPI ) ，比较了常用的两种干燥方式对 pH 改性 PPI 功能性 的影响，并利用 SDS － PAGE 和红外光谱法研究了两种干燥方式对 pH 改性 PPI 结构的影响。研究 结果表明: 与冷冻干燥相比，喷雾干燥使改性处理后的 PPI 形成较多聚集体，同时使蛋白质的功能 性质( 溶解性、乳化性、胶凝性) 略微降低; 经过 pH 改性处理喷雾干燥 PPI 的乳化性和胶凝性显著 高于未改性处理冷冻干燥 PPI ，喷雾干燥后 PPI 亚基发生更多的非二硫键共价聚集，使 PPI 发生部 分变性，二级结构发生了变化。总之，喷雾干燥对 PPI 的功能性质有降低趋势，而 pH 改性处理可 以大大改善  PPI 的功能性质从而弥补喷雾干燥带来的不足。 关键词: 豌豆分离蛋白; 喷雾干燥; 冷冻干燥; pH 改性; 功能性; 结构 中图分类号: TS214; TQ936．
2 文献标志码: A
文章编号: 1003
－ 7969( 2014) 03 － 0074 － 06 Influences of drying methods on function and structure of  pH － modified pea protein isolate LI Kaifang ，JIANG Jiang ，LIU Yuanfa
( School of Food Science and Technology ，Jiangnan University ，Wuxi 214122，Jiangsu ，China ) Abstract: Pea protein isolate ( PPI ) was obtained from pea ． The effects  of two common drying methods on  the function of pH － modified PPI were compared ，and the structural changes of pH － m odified PPI were investigated by SDS － P AGE and infrared spectrosco py ． The results showed that spray drying method in- duced more aggregates of pH － m odified PPI than freeze drying method ，at the same time ，the functional  properties of proteins ( s olubility ，emulsification ，gelation ) reduced slightly ; pH － m odified P PI dried by spray drying showed significant increase in gelation and emulsification comparing with PPI dried by freeze drying ． After s pray drying ，the subunits of PPI had more covalent aggregation of non disulfide bonds ， part of PPI was denatured and the secondary structure of PPI changed ． These results indicated that the functional properties of PPI decreased after spray drying ，while the pH － modification treatment could im- prove the functional properties of PPI and make up the disadvantages brought by spray drying ． Key  words:  pea protein isolate ; spray drying ;
freeze drying ;
pH － modification ;
functional
property ; structure
目前工业上常用冷冻干燥和喷雾干燥两种干燥
方式对植物蛋白进行干燥，为了降低生产成本，普遍 采用喷雾干燥法。但是已有研究表明
［1］
，不管采用
何种干燥方式，大豆蛋白在干燥后功能性质及结构 等都发生了显著变化。在喷雾干燥过程中，虽然处 理时间短，但由于其较高的温度，蛋白质仍会发生部 分变性，势必会影响蛋白质的功能性质及结构的变 化。冷冻干燥得到的植物蛋白通常被认为是未变性 的，因为干燥前后溶解度及其他功能性质并没有发
收稿日期: 2013
－ 05 － 20; 修回日期: 2013 － 11 － 21 基金项目: 国家高技术研究发展计划 (  863 计划)  (  2013AA  102103)
作者简介: 李开放(  1987)  ，男，硕士研究生，主要从事植物蛋 白方面的研究工作( E-ma il ) kaif angle e0214@ gma il ． co m 。 通信作者: 刘元 法，教 授，博 士 生 导 师 ( E-mail ) foodscilyf @ 163． com 。
2014 年 第 39 卷 第 3 期 中  国 油  脂
75
液调至同样的离子强 度，最终离子强度为 0. 025
mol / L 。将 pH 改性处理( pH 1. 5 和 pH 12. 0 ) 的蛋 白溶液离心去盐后分别进行喷雾干燥和冷冻干燥， 置于 4 ℃ 下保存备用。 生明显改变。
豌豆中的蛋白质含量在 13. 7% ～ 30. 7% 之间， 帄均含量  22. 3%
［2］
。由于豌豆蛋白的功能性质相
对较差，在食品中的应用仍然有限。因此，有必要寻 求
一种有效的改性方法来改善其功能性，以拓宽其 应用范围。pH  改性处理是一种简单易行且节约能 源
的处理方法。Kristinsson ［3］
、
Liang ［4］  等报道了肉 蛋白和卵清蛋白经 pH 偏移处理后蛋白质结构改 变，进而引起蛋白质的凝胶性、乳化性和溶解性等功 能性质的显著提高。蒋将
［5］
研究了  pH 偏移处理诱 导熔
球态大豆蛋白的结构变化及功能性质的改善， 结果
表明这种改性方法可以明显地提高大豆蛋白的 溶解性、乳化性和乳化稳定性等功能性质。
改善豌豆分离蛋白(  PPI )  的功能性，对拓宽豌 豆蛋白在食品中的应用范围具有重要意义。因此， 本实验着重研究了不同干燥方式对 pH 改性 PPI 的 功能性质和结构的影响，以期为进一步的研究提供 理论
依据。 1 材料与方法 1. 1 实验材料
豌豆，购于无锡雪浪农贸市 场;  丙 烯 酰 胺、 N ，N' － 甲叉双丙烯酰胺( Bis ) 、β － 巯基乙醇，购于 Sigma 公司; SDS － PAGE 用标准蛋白，购 于 BIO － ＲAD 公司; 十二烷基磺酸钠(  SDS ) 、盐酸、氢氧化钠 等分析纯试剂，购于中国医药上海化学试剂公司。
J － 26 XPI 高速冷冻离心机，ACPHA1 － 4 冷冻
干燥机，高速离心喷雾干燥机，pH 计，UV － 2800H  型紫外可见分光光度计，Nano ZS 纳米粒度分析仪，    1. 2. 3 动态光散射分析
将 pH 改性处理前后的 PPI 样品用去离子水配
制成 1 mg / m L 蛋白溶液。采用纳米粒度分析仪测 定样品的帄均粒径分布，测定温度为 25 ℃ 。 氨基酸组成分析 1. 2. 4 称取 120 mg 左右 pH 改性处理前后的 PPI 样品 于水解管中，加入 6 mol / L 的 HCl 8 mL ，充氮封口后 于 110 ℃ 烘箱中水解 24 h ，取出冷却转移至 25 mL  容量瓶定容，过滤，离心，采用氨基酸分析仪测定氨
基酸组成及含量。 1. 2. 5 溶解度的测定
采用双缩脲法。先制作标准曲线，然后移取用 去离子水配制成 10 mg
/ L  蛋白溶液 1 mL 于 1. 5 mL  离心管中，
12 000 r / m in 离心 10 min 。吸取 0. 25 mL  上清液于试管中，加入 0. 75 mL 去离子水稀释，加入 mL 双缩脲试剂，充 分摇匀后，在 室温下放置 30 4 min ，于 540 nm 处测定吸光度，即为上清液中蛋白浓 度。吸取 0. 25 mL 不经离心的蛋白溶液，用同样的 方法测定总蛋白浓度。溶解度定义为上清液中蛋白 浓度与总蛋白浓度的比值。 浊度的测定
1. 2. 6 采用浊度法［5］
并稍加改动。将 PPI 样品用去
离子水配 制 成 2 mg / m L 蛋 白 溶 液，于 600 nm 处
测定吸光度。
L8800 氨基酸分析仪，Ultra － Turrax  高速均质 T18 乳化性的测定
1. 2. 7 机，电泳仪，凝胶成像仪，傅里叶红外光谱仪。
1. 2 实验方法 1.
2. 1 PPI 的制备
以豌豆为原料，根据文献［6］的方法制备  PPI 。 将粉碎的豌豆粉用正己烷 － 乙醇( 体积比 10 ∶ 1 ) 脱 脂。得到的脱脂粉末分散在去离子水中 (  料液比 1∶ 10) ，用 2 mol / L  NaOH 将 pH 调至 8. 0，13 500 × g  参考文献［7］的浊度法。将  PPI 样品配制成质
量浓度为 10 mg / m L 的蛋白溶液，取 15 mL 蛋白溶液
与 5 mL 大豆油混合，放入 100 mL 玻璃大试管中，使 用高速乳化均质机乳化 2 min ，转速为 13 500 r / m in ， 将乳化液迅速倒入 25 mL 小烧杯中，立即取样。取 20 μL 的乳化液与 5 mL 0. 1% 的 SDS 混合均匀( 稀 释 251 倍) ，在 500 nm 处测定吸光度，用 0. 1% 的 SDS 做空白对照。
乳化性计算公式:
离心 30 min ，得上清液。再用 2 mol / L  HCl 将上清 液的 pH 调至 4. 5 后，3 300 × g 离心 20 min ，将得到 的沉淀分散在水中，最后用 2 mol / L NaOH 调 pH 至 7. 0，分别进行冷冻干燥和喷雾干燥后，置于 4 ℃ 下 保存备用。
1. 2. 2  pH 改性处理［5］
2 × 2. 30
3 × A 500
×
10 000 × 稀释倍数 EAI =
C × ( 1 － Φ) 式中: EAI 为乳化性，
m 2 / g ; C 为乳化前的蛋白 质量浓度，
g / mL ; Φ 为乳状液中油的体积分数; A  为 500 nm 处的吸光度。
500 将 20 mg / m L 的 PPI 溶液分别用 2 mol / L  HCl 12. 0，处 理 和 2 调 至 和 胶凝性( 最小凝胶浓度) 分析 mol / L  NaOH  pH  1. 5 pH    1. 2. 8 1 h ，之后将 pH 调回至中性处理 1 h ，处理后蛋白溶
取 0. 6 ～ 2. 0 g PPI 样品溶于 10 mL 水中，用磁
76 CHINA OILS AND FATS  2014 Vol. 39 No. 3
力搅拌器搅拌均匀，制成 60 ～ 200 mg
/
m L 的蛋白溶 液，将 pH 调整到 7. 0。然后 90 ℃ 加热 30 min ，冰浴 此，研究了干燥方式对 pH 改性 PPI 的氨基酸组成
及含量的影响，结果见表 2。
表 2  干燥方式对 PPI 氨基酸组成及含量的影响 %
min ，于 4 ℃ 条件下静置过夜。把试管倒置，不流 20 出来的样品定义为(  + ) ，可形成自持凝胶; 反之为 氨基酸 PPISN PP ISA PPISB  PPIFN P PIFA P PIFB  ( － ) ，
不能形成凝胶。形成自持凝胶的最低蛋白浓 天冬氨酸 谷氨酸 丝氨酸 组氨酸 甘氨酸 苏氨酸 精氨酸 丙氨酸 酪氨酸 半胱氨酸 缬氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 脯氨酸
10. 512 9. 922 10. 056 10. 400 10. 506 10. 471
19. 351 18. 294 18. 732 19. 904 19. 946 19. 916 度定义为最小凝胶浓度。
1. 2. 9 蛋白凝胶电泳分析
参照文献［8］的还原和非还原方法，稍加改动。 采用 12% 分离胶，5% 浓缩胶，电泳采用 1 mm 凝胶
板，电泳 PPI 样品用上样缓冲液配制成质量浓度为  2 mg / m L 蛋白溶液，沸水加热 3 min ，考马斯亮蓝染 ，上样量 10 μL ，开始电泳时电流为 20 mA ，待样品 进入分离胶后改为 40 mA 。还原电泳加入 β － 巯基 乙醇，非还原电泳不加 β － 巯基乙醇。 1. 2. 10 傅里叶红外光谱分析
取少量的 PPI 样品以适当的比例与 KBr 混合， 研磨均匀，压片，于傅里叶红外光谱仪中扫描，每个 样品的红外图谱为扫描 16 次的叠加图。
4. 188 2. 355 3. 499 2. 669 8. 670 3. 325 2. 782 0. 445 4. 613 0. 973 4. 906 4. 172 7. 383 6. 493 3. 223    4. 463 2. 221 3. 517 2. 776 8. 671 3. 496 2. 826 0. 544 4. 376 1. 020 4. 689 3. 961 7. 245 6. 333 3. 099    4. 509 2. 390 3. 540 2. 829 8. 763 3. 536 2. 971 0. 534 4. 444 1. 024 4. 754 4. 015 7. 332 6. 387 3. 745 4. 195 2. 463 3. 387 2. 607 8. 963 3. 158 2. 843 0. 407 4. 485 0. 891 4. 681 4. 055 7. 278 6. 559 3. 284    4. 056 2. 408 3. 373 2. 599 8. 897 3. 152 2. 880 0. 314 4. 459 0. 794 4. 740 4. 067 7. 223 6. 394 3. 740    4. 242 2. 427 3. 388 2. 641 8. 921 3. 185 2. 914 0. 285 4. 350 0. 808 4. 822 3. 980 7. 259 6. 387 3. 566
结果与讨论 干燥方式对 pH 改性后 PPI 溶液中粒径分布的影响
表 1 显示了不同干燥方式的 PPI 溶液中的粒径 2 2. 1 由表 2 可以看出，PPI 中的氨基酸组成，以谷氨
酸、天冬氨酸、精氨酸、亮氨酸、赖氨酸含量较高。含 硫氨基酸蛋氨酸和半胱氨酸含量最少，这是 PPI 的 凝胶性很差的主要原因。与未改性 PPI 相比较，两 种干燥方式的 PPI 氨基酸含量没有发生明显的变 化，说明喷雾干燥的 pH 改性 PPI 几乎没有赖丙复 合物的产生，且干燥方式不会破坏 pH 改性 PPI 的 氨基酸组成。
2. 3  干燥方式对 pH 改性后 PPI 溶解性的影响( 见 图 1)
分布具体分析结果。
表 1    不同干燥方式的 PPI 粒径分析结果
项目
PPISN  PPISA  PPISB PPIFN PPIFA  PPIFB
帄均粒径 /
n m  PDI
2 620 0. 567 1 105 0. 712 893. 0 1. 000 108. 8 94. 15 0. 489 0. 530 56. 39 0. 231 注: PPISN 表 示 未 改 性处理喷雾干燥的 PPI ; PPISA 和
PPISB 分别表示经 pH 1. 5 和 pH 12. 0 改性处理后喷雾干燥 的 PPI ; PPIFN 表示未改性处理冷冻 干 燥 的 PPI ;  PPIFA 和 PPIFB 分别表示经 pH 1. 5 和 pH 12. 0 改性处理后冷冻干燥 的 PPI 。下同。
由表 1 可以看出，两种干燥方式的蛋白粒径大 小具有显著的不同。pH 改性处理的样品经过冷冻 干燥后帄均粒径较小; 而经过喷雾干燥后帄均粒径 相对较大。说明在喷雾干燥过程中产生的瞬间高温 会导致不可溶大颗粒的聚集形成，可能是由于二硫 键或疏水相互作用形成的聚集物
［5］
。而且还发现，
喷雾 干 燥 制 备 的 样 品，
其 蛋白质分散指数  PPI 图 1  干燥方式对不同 pH 改性处理后 PPI 溶解度的影响
(  PDI )  普遍高于冷冻干燥样品，说明喷雾干燥过程 的高温过程对溶解度也产生了一定的不利影响。 2. 2 干燥方式对 PPI 氨基酸组成的影响
蛋白质在极端碱性条件下，主链的肽键断裂将 影响一级结构的变化，二级结构也会发生重大变化， 同时二硫键可能发生断裂或者与巯基之间发生交换 反应
［9］
。但是伴随加热处理，半胱氨酸将发生 β － 消
除反应从而导致毒素赖丙复合物的生成
［10］
。因
溶解度是蛋白质最重要的功能特性之一，溶解
度的高低往往决定了蛋白质其他功能特性的强弱。 因此，测定 PPI 的溶解度对于了解 PPI 的初始状态 及其功能特性的变化都有一定的指导意义。由图  1 可以看出，
pH 12. 0 改性处理可以提高 PPI 的溶解 度，但不同的干燥方式对  PPI 的溶解度也有一定的 影响，喷雾干燥  PPI 的溶解度较冷冻干燥的低。原
2014 年 第 39 卷 第 3 期 中  国 油  脂
77
因在于喷雾干燥相对冷冻干燥变性程度较大，而蛋 白质的热变性会导致溶解度的下降。
成较多聚集体，因此前者较后者的乳化性略低。而 经过 pH 改性处理后的喷雾干燥 PPI 的乳化性明显 高于未改性冷冻干燥 PPI 的，从而减弱或抑制了喷 雾干燥产生的不利影响。
2. 6 干燥方式对 pH 改性后 PPI 的胶凝性影响( 见 表 3)
及的结构表 3  干燥方式对 PPI 胶凝性( 最小凝胶浓度) 的影响 2. 4 图 2)
干燥方式对 pH 改性 PPI 溶液浊度的影响( 见 蛋白质 量浓度 / ( mg / m L ) PPISN  PPISA  PPISB PPIFN  PPIFA  PPIFB  60
80 100 120 140 160 180 200
－ － － － － － + +
－ － － － + + + +
－ － － － + + + +
－ － － － － + + +
－ － － － + + + +
－ － － － + + + +
图 2  干燥方式对不同 pH 改性处理后 PPI 浊度的影响
由图 2 可以看出，冷冻干燥 PPI 的浊度明显要
低于喷雾干燥 PPI 的，但是经过 pH 12. 0 改性处理 的喷雾干燥 PPI 相对于未改性喷雾干燥 PPI ，浊度稍 微降低，弥补了喷雾干燥带来的不足。这些变化在 蛋白样品溶解的过程中通过肉眼也可以观察出来。 在一定程度上，浊度的变化与蛋白质的溶解度是相 关的。
胶凝性最重要的一个指标就是最小凝胶浓度 ( LGC ) ，将其定义为形成自持凝胶所需的最低浓度。 LGC 较低的蛋白质具有较好的胶凝能力。由表 3 可 以看出，随着蛋白质量浓度的增加，凝胶强度变大。 未改性处理冷冻干燥和喷雾干燥 PPI 的 LGC 分别 是 160 mg / m L 和 180 mg / m L ，说明喷雾干燥后 PPI  的凝胶性有所下降; 而经过 pH 改性处理后冷冻干 燥和喷雾干燥 PPI 的 LGC 都为 140 mg / m L ，且喷雾 干燥形成的凝胶强度要比冷冻干燥的大，说明    pH  改性处理可以明显提高  PPI 的胶凝性，并弥补了喷
雾干燥带来的不利影响。
2. 7 干燥方式对 pH 改性后 PPI 的 SDS － PAGE 分 析( 见图 4)
采用 SDS － PAGE 分析了喷雾干燥和冷冻干燥 对 pH 改性处理的 PPI 的结构影响，包括由二硫键 2. 5 图 3)
干燥方式对 pH 改性后 PPI 乳化性的影响( 见 图 3  干燥方式对不同 pH 改性处理后 PPI 乳化性的影响
乳化性是指将油和水混合在一起形成乳状液的
性能，是蛋白质的一项重要指标。PPI 具有两亲性， 它可以降低油水界面的表面张力，可以帮助形成乳 化体系并维持体系稳定。从分子结构来看柔性分子 具有较高的乳化能力，而球蛋白的乳化能力低，PPI  主要由 7S 和 11S 球蛋白组成。由图 3 可以看出， pH 改性处理可以明显提高 PPI 的乳化性，而喷雾干 燥的 PPI 乳化性要略低于冷冻干燥 PPI 的。由于蛋 白质的乳化性同时受溶解性和疏水性的影响［11］
，较 低的溶
解性和被破坏的表面疏水基团导致了喷雾干 燥蛋白质
EAI 的减少。
pH 改性处理使蛋白质结构展开，隐藏在分子内 部的疏水基团暴露出来，使蛋白质表面疏水性增强。 一般地，表面疏水性同蛋白质的乳化性存在明显的 正相关
［12］
。由 图 3 可知，喷 雾干燥和冷冻干燥的
PPI 相比，由于喷雾干燥使 pH 改性处理后的 PPI 形
生成而产生的聚集以及各亚基的解离等。SDS  － PAGE 分析样品分不加 β － 巯基乙醇的和加 β － 巯 基乙醇的。由图 4 可以看出，当样品中不加 β － 巯 基乙醇时，经过 pH 改性处理后，可以观察到分离胶 顶部有聚集物，当样品中不加 β － 巯基乙醇时，分离 胶顶部的大分子聚集物完全解离成 11S 的 A 、B 亚 基。比较加与不加 β － 巯基乙醇结果可知，这些大 分子聚集物是由于豌豆球蛋白的二硫键共价聚集产 生的，而经过喷雾干燥的样品，可以观察到分离胶顶 部仍然有聚集物，很可能是由于豌豆球蛋白的非二 硫键的共价键导致的，因为 β － 巯基乙醇已将蛋白 质中的二硫键破坏。SDS － PAGE 图分析结果表明，
78 CHINA OILS AND FATS  2014 Vol. 39 No. 3
要原因是产生了大分子聚集体，
7S 和 11S 的大多数 亚基含量减少。这些结果与溶解度的测定结果是一 致的。
pH 12. 0 改性处理后的 PPI 溶解度增加的主要原因
是 pH 改性处理时 11S 的 AB 复合体部分解离，而部 分解离了的 A 、B 亚基以及 7S 的亚基可能聚集生成 可溶性大分子。喷雾干燥后的  PPI 溶解度降低的主
图 4    不同干燥方式及 pH 改性处理的 PPI 加 β － 巯基乙醇( 左) 和不加 β － 巯基乙醇( 右) SDS － PAGE 图
变，酰胺基谱带的最高点就会发生迁移，酰胺基谱带
向低波数迁移说明 β － 折叠的增加［14］
。由图 5 ( b ) 可以看出，不同 pH 改性处理的 PPI 经不同干燥方 式干燥后的酰胺基吸收峰变化趋势不同，喷雾干燥
和冷冻干燥相比，未改性处理的酰胺基谱带的最高 点左移，α － 螺旋含量相对增加; pH 1. 5 改性处理的 酰胺基谱带的最高点变化不大，而 pH 12. 0 改性处 理的酰胺基谱带的最高点右移，α － 螺旋含量相对 减少。由图 5 还可以看出，喷雾干燥的所有样品相 对于未改性处理冷冻干燥的样品，酰胺基谱带的最 高点都左移，说明 β － 折叠含量不同程度的降低，原 因可能是由于喷雾干燥过程中较高的温度，使 得 PPI 部分变性，蛋白质发生热降解。
2. 8 干燥方式对 pH 改性后 PPI 的傅里叶红外光 谱分析
蛋白质和多肽在红外区域表现为 9 个特征振动 模式或基团频率，其中最常用于二级结构分析的是 酰胺 I 带，包括 C  O 伸缩，较弱的 N —H 弯曲和
C —N 伸缩，位于 1 700 ～ 1 600 cm － 1 范围［13］。图 5
是不同干燥方式及不同 pH 改性处理对 PPI 结构的 影响。由图 5 可以看出，改性前后和不同干燥方式
cm － 1
附
PPI 的 N —H 伸缩振动峰在 3 294 ～ 3 296 近，变化不大，说明不同的干燥方式对 PPI 的氢键影 响较小。
典型的氨基酸和蛋白质的酰胺基谱带的形状是 由二级结构决定的。如果蛋白质的二级结构发生改
注: 1、
8. PPIFA ; 2、7. PPIFB ; 3、9. PPIFN ; 4、11. PPISA ; 5、12. PPISB ; 6、10. PPISN 。 图 5  PPI 的傅里叶红外光谱图
3 结 论
PPI 经 pH 改性以后，功能性质得到了显著的改 善。不同的干燥方式对 pH 改性 PPI 的功能性具有 不同的影响。相对于冷冻干燥，由于喷雾干燥过程
中的高温处理会形成大颗粒聚集，发生部分变性，因
此 PPI 粒径明显变大，溶解性下降，胶凝性降低，同 时浊度增加，但没有破坏氨基酸的组成从而未产生 毒素赖丙复合物。但经过  pH 改性处理喷雾干燥的

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。