jtc/i'nm F MeKmi）2019'Dec；38（6）%989-96-989-
•论著.
HLA-A020l)AllOl和A24U2限制性HBV
抗原肽的虚拟预测与实验鉴定
赵晨5，金萧萧5，丁艳5，昂倩倩5,Odontuyy Khaidva5，夏玲芝2，邱洁3，沈传来5
(1.东南大学医学院病原生物学与免疫学系，江苏南京210009；2-南京金域医学检验所自身免疫病检测中心，
江苏南京210032；3-南京市第二医院传染病科，江苏南京210003)
：摘要］目的：筛选和鉴定基因总频率>50%的3种人类白细胞抗原(HLA)(A0201、A1101和A2402)分子限
制的乙型肝炎病毒(HBV)抗原T细胞表位肽。方法：利用6种在线T细胞表位肽预测数据库，针对乙肝病毒
表面抗原、核心抗原、DNA多聚酶和X蛋白等4种抗原，虚拟筛选3种HLA-A分子限制的T细胞表位肽。
从南京市第二医院检验科收集乙型肝炎住院患者的外周抗凝血，制备外周血单个核细胞，通过)干扰素酶联
免疫斑0法(IPN-ELISPOT)筛选出对任何一组混合多肽呈现特异T细胞反应的乙型肝炎患者；重新采集
这些乙型肝炎患者的新鲜外周血，用IPN-)ELISPOT法鉴定混合肽中单种抗原肽的免疫原性；并采用聚合酶
链反应-测序分型法对这些乙型肝炎患者进行HLA-A等位基因分型。结果：经鉴定具有免疫原性的HLA-
A0201分子限制性HBV表位肽8种，A1101限制性HBV表位肽6种，A2402限制性HBV表位肽7种。
结论：本研究筛选鉴定了3种HLA-A分子限制的4种HBV抗原的21种T细胞表位肽，其中11种未见报道，
而且HLA-A1101分子限制性表位肽的免疫原性明显弱于HLA-A0201和A2402分子限制性表位肽。
：关键词］人类白细胞抗原-A；乙型肝炎病毒；T细胞表位肽；)干扰素酶联免疫斑0法
：中图分类号］R373.21；R392.1：文献标识码］A：文章编号］1671-6264(2019)06-0989-08
doR10.3969/j./sn.1671-6264.2019.06.012
Virtral preCiction and experimectal identidcation of HBV antigecic
peptides restricteC by HLA-A020l，AllOl and A2402
ZHAO Chen5，JIN Xinoxino5，DING Yan5，ANG Qianqian5，ODONTUYA KhaiUav5，
XIA Lingzhi2，QIU Jin3，SHEN Chuanlai5
(1.Depagment f Pathogenic Biology and Immunology，Medical School，Southeasi University，Nanjing210009，China；
2.Detection Center for Autoimmune Diseases，Nanjing Kingmee Clinical Laboratory，Nanjing210032，China；
3. Division+Infectious Diseases，the Secood Hospital+Nanjing，Nanjing210003，China)
&Abstraci］Objective:To screen and identify the hepatitis B virus(HBV)antigenic T cell epitopes rest/cted by human leukocyte antigen(HLA)-A0201，A1101and A2402which have a total gene frequency of>50%in Chl-
&收稿日期］2019-03-25［修回日期］2019-07-16
&基金项目］江苏省科技支撑计划社会发展重点项目(BE2017714)；南京市医学科技发展基金重点项目(ZKX19043)
［作者简介］赵晨(1994-)，女，安徽宿州人，在读硕士研究生。E-mail：zhaochen419107@163.-om
&通信作者］邱洁E-mail：139********@163；沈传来E-mail:chuanlaishen@seu.edu.o
&引文格式］赵晨，金萧萧，丁艳，等-HLA-A0201)A1101和A2402限制性HBV抗原肽的虚拟预测与实验鉴定&J］•东南大学学报(医学版)，2019，39(6)：999996.
-990-东南大学学报(医学版)2019年12月，38(6)
n—e population.Methods:Sio online data banks for T cell epitopes prediction were used to vibu—l y screen the T
ce i epotopesdeeoeed teom HBsAg，HBcAg，HBpoiand HBipeoteonsand eesteocted b[thetheeeHLA Amoiecuies，eespectoeei.Peeopheeaiantocoaguiatoon sampiesteom HBV ontected on-patoentsweeeco e cted teom theDepaetment
otCionocaiLaboeatoe[otNanaongtheSecond Hospotai，and peeopheeaibiood mononucieaece s(PBMCs)weeepeo-
cessed.Then the inteBeen-)enzyme linked immunospot(IFN--LISPOT)—say was peBonned to screen
out the patoentswh#had thespecotocTce i eesp#nsest thec#cktaoi#tpeptodes.Theteesh peeopheeaibi#d sampiesweee
c#e cted agaon te#m thesepatoentsand theommun#genocoty#teach peptodewasc#ntoemed bytheIFN-)ELISPOT
a s ay.Meanwhoie，HLA Agen#typongwasca e oed#uton theseHBV ontected patoentstheugh p#iymeeasechaon ee
action-sequencing-based typing(PCR-SBT)method-Resslts:The immunog—Pip of eight epitopes restricted by HLA A0201，)oiepotope)ee)teocted byA1101，and)eeen epotope)ee)teocted byA2402weeecontoemed bytunctoon-
al expeBment.Conclusion:Twenty-one T col l epitopes have been identified,which deBved from four kinds of HBVpeotonsand e'steoctd bythe'HLA-Amoicuis，e'sp'ctoe'iy.Otth'm，'ie'n'potop'shae'notb''n e'-poetd b'toe.Moeoe'e，th'ommunog'nocotyotth''potop'sesteoctd byHLA A1101ossognotocantiyw'ak'ethan thatesteoctd byHLA-A0201and A2402.
&Key words'human kukocyte antigen-A；hepatitis B virus;T cell epitope;inmBeen--enzyme linked immunospot —say
人类白细胞抗原(human leukocyta antigen,HLA)基因系统是人类主要组织相容性复合体，是一组紧密连锁的基因。每个HLA基因座位在人中都有大量的等位基因。在不同个体之间这些等位基因并不完全相同。由于分子结构差异，每种等位基因编码的HLA分子所能结合和提呈的抗原肽序列各不相同，亲和力也有差异［1］，因此同一病原体进入不同个体后引起的特异性免疫应答反应强弱不同。这是人体抗感染能力存在个体化差异的主要原因之一，即HLA基因的个体差异［2］(
在我国约6亿人感染乙型肝炎病毒(HBV)，慢性感染者占总人口的8%~10%［3］，而慢性乙型肝炎(CHB)又是导致肝硬化、肝衰竭及肝癌的主要因素，因此HBV感染成为我国严重的社会和公共卫生问题。抗病毒是CHB的最根本措施，核昔(酸)类似物(NAs)是当前的最主要药物，但其只能抑制HBV复制，无法彻底清除HBV。这一缺陷使CHB患者停药后的复发成为严峻问题⑷。HBV诱发肝炎的机制尚不明确，但机体不同强度的免疫应答与HBV的清除、肝炎的发生以及疾病的预后密切相关，其中HBV抗原特异性CD8j T细胞的免疫反应尤为重要&5-'，而该免疫应答反应主要由病毒感染细胞的HLA-A、B、C等提呈HBV抗原肽给特异性CD8+T细胞而启动和控制［7］。但是，目前已明确的被各种HLA分子所限制和提呈的HBV抗原肽仍然很少金10'，从而限制了对不同HLA等
基因HBV原T胞的监测，也限制了基于HLA基因个体差异性及其提呈HBV抗原肽差异性的精准免疫研究。
本研究选择在中国人中基因总频率＞50%的HLA-A0201)A1101和A2402等3种HLA分子&11-2',
lol更新速度限制系统地虚拟预测其所限制的4种HBV抗原的T细胞表位肽，并通过功能性实验验证其免疫原性，为后续特异性免疫和免疫检测研究奠定基础。
1资料和方法
1-1一般资料
2018年8月至11月在南京市第二医院收集慢性乙型肝炎患者的外周抗凝血样，共计126例。所有慢性乙型肝炎的诊断均符合国家卫生部颁布的《乙型病毒性肝炎诊断标准！WS299-2008)》，并排除艾滋病毒和其他肝炎病毒感染，以及排除血液系统疾病。其中男105例，女21例，年龄28-75岁，平均(52-6±12.1)岁。
1.2引物与多肽合成
HLA-A基因位点的聚合酶链反应！PCR)引物根据国际HLA工作组(IHWG"第13届会议推荐的标准方法设计［13］，如表1所示。所有引物均在上海桑尼生物科技公司合成。25种多肽均由苏州强耀生物科技公司合成，纯度＞95%。
赵晨，等-HLA-A0201）A1101和A2402限制性HBV抗原肽的虚拟预测与实验鉴定-991-表l HLA-A位点特异性的PCR扩增引物
引物序列（5，-3，）退火位点基因座位长度
A1 A3GAAACSGCCTCTGYGGGGAGAAGCAA
TGTTGGTCCCAATTGTCTCCCCTC
内含子1：21-26
内含子3：66-99
HLA-A995bp
1-3预测3种HLA-A分子限制的4种HBV抗原的优势T细胞表位肽
选取4种HBV蛋白：表面抗原（HBsAg）、核心抗原（HBcAg）、DNA多聚酶（HBpol）和X蛋白！HBx），通过UniX/t全球蛋白资源数据库检索获得其氨基酸序列，选择研究最多的标准序列，其中HBsAg为D基因型adw的氨基酸序列；再通过SYFPEITHI、BIMAS）SVMHC、IEDB、NETMHChe和EPIJEN等6种常用的表位肽预测数据库对HLA-A0201）A1101和A2402分子限制的针对上述每种HBV蛋白的T细胞表位肽进行虚拟预测。HLA I类分子的抗原结合凹槽两端封闭，接纳的抗原肽长度为8-11个氨基酸残基，其中以9或10个氨基酸最为常见，因此，本实验分别选择9个和10个氨基酸长度的多肽作为虚拟预测对象。
针对每种HLA-A分子和每种HBV蛋白，将不同数据库预测出的9肽和10肽分别按所得评分从高到低进行排列，再从中选择至少满足两种以上预测方法评分标准的表位肽作为候选表位肽。针对每种HBV 蛋白，再从每种HLA-A分子限制性的候选表位肽中选出评分最高（亲和力最高）的1~4种多肽作为待鉴定表位肽。
1.4鉴定HBV抗原T细胞表位肽的免疫原性
取室温保存的新鲜抗凝全血，用人淋巴细胞分离液（达科为生物，深圳）常规分离HBV慢性感染者外周血单个核细胞（PBMC），用无血清培养基（达科为生物，深圳）重悬，细胞计数，调整细胞浓度为21 106ml5备用。
首先筛选出对混合肽组合有阳性反应的HBV慢性感染患者：将每种HLA-A分子限制的针对4种HBV 蛋白的待鉴定表位肽混合为一组，每组8~9种表位肽；取预包被抗人IN-）抗体的酶联免疫斑点法（ELISPOT）反应板（达科为生物，深圳），用无血清培养基（200!-•孔-1"活化8min，每孔加入HBV慢性感染者PBMC悬液（100!-•孔-1）；然后在检测孔中补加每种HLA-A分子限制的混合肽，混合肽中单种多肽为14!g•ml-5，在阳性对照孔补加PHA（2.5!g•ml5），在阴性对照孔补加与检测孔相同浓度的DMSO 多肽溶解液；置37e、5%CO2培养箱孵育40~48h；其余步骤按照人ELISPOT试剂盒说明书操作。若阴性孔斑点数为0~5时，检测孔-阴性对照孔斑点数# 5判定为T细胞反应阳性；若阴性对照孔斑点数#5时，检测孔#2倍阴性孔斑点数判定为T细胞反应阳性。
鉴定单种表位肽的免疫原性：重新收集对混合肽有T细胞阳性反应的HBV慢性感染者的PBMC，加入上述ELISPOT板中，每个检测孔中补加阳性混合肽中的单种HBV多肽（50!g•ml5），同上设置阳性对照孔和阴性对照孔，置37e、5%CO2培养箱孵育40-48h，同上做ELISPOT检测。T细胞反应阳性孔即表示该孔内的待鉴定表位肽具有免疫原性。对该HBV 感染者进行HLA-A等位基因分型，结合该表位肽的虚拟亲和力，明确其被哪种HLA-A分子所限制和提呈。
1.5HLA-A等位基因分型
选择在表位肽鉴定实验中呈T细胞阳性反应的HBV慢性感染者，取200!抗凝血，利用人全血基因组DNA提取试剂盒（天根生物，北京）提取基因组DNA；采用HLA-A位点特异性引物A1和A3进行PCR，扩增A位点的外显子2、内含子2、外显子3以及部分内含子1和3的DNA序列，产物大小为985bp（扩增条件为：95°C预变性3md；95°C变性15s；62e 退火15s；72C延伸90s；35个循环；72C延伸5min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定大/J、，并送上海桑尼生物科技公司进行纯化和双向测序。PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技公司。
通过Lasergene程序的Seqman软件把外显子2和外显子3的测序结果拼成一条完整的HLA-A重叠序列，检查双向测序的碱基是否完整一致，出杂合子的碱基并用兼并碱基表示，确定扩增的HLA-A基因序列。利用Nucleotide BLAST工具，将拼接好的HLA-A 序列与数据库中所有HLA-A等位基因的外显子2和外显子3序列进行比对，直至获得完全匹配的基因组合，从而确定HLA-A的等位基因。
1.6统计学处理
采用GraphPad P/sm6.0软件分析数据，用非配对t检验比较不同HLA-A分子所限制表位肽的ELISPOT斑点数差异，P<0.05为差异有统计学意义。
-992-东南大学学报（医学版）2019年12月，38（6）
2结果
2-1虚拟预测3种HLA-A分子限制的4种HBV蛋白的T细胞表位肽
6种表数据库的预测，根据每种预测方法的准筛选种HLA-A分子的候选HBV抗原T细胞表位肽，每种HLA-A分子再从中选拟的4种HBV蛋白的8〜9种表鉴定表，共计25条，依次命名为P1至P25o
2-2HLA-A等位基因分型结果
通过上述PCR-sequencing-based typing（SBT）法，对14例与待鉴定表T细胞的HBV慢性感行HLA-A等位基因分型。PCR扩增所得DNA片段与大致（985bp，图1A）；L—sergenc软件的Seqman工拼接测序序列（图1B），结果峰图单一、没有杂峰，可以HLA-A基因o
序列比对，其中10例患者为杂合子，4例患者为纯合子;HLA-A$02：01阳性患者3例，HLA-A* 11%01阳性患者5例,HLA-A*24：02阳性患者8例。
2.3鉴定虚拟预测的HBV抗原T细胞表位肽的免疫原
通过ILN-）ELISPOT方法从126例HBV慢性感染者中选出14例对HBV T细胞
的患者。再重新收集这些患者的PBMC，用ELISPOT
A.PCR扩增HLA-A的DNA电泳图,M为5000bp DNA markcs；泳道1~6为不同HBV慢性感染者PCR产物；
B.HLA-A等位基因序列拼接
图l PCR-SBT法HLA-A等位基因分型
法进行单种表位肽免疫原性的验证，然后结合患者的HLA-A等位基因以及表位肽与等位基因的虚拟预测亲和力进行综合分析。结果显示:HLA-A0201限制的9种待鉴定肽中（P1〜P9"，有8种能刺激HLA-A *02%01阳性患者PBMC呈现T细胞阳性反应（图2）；在HLA-A1101限制的8种待鉴定肽中（P10-P17），有6种能刺激HLA-A*11：01阳性患者PBMC呈现T细胞阳性反应（图3）；在HLA-A2402限制性的8种待鉴定肽中（P18-P25），有7种能刺激HLA-A*24%02阳性PBMC呈现T细胞（图4）（在种HLA-A
分子的HBV表之原性存在明显差异。同时，有很多表现HLA分子交制性：P3、P5、P8、P18和P22为HLA-A0201）A1101和A2402分子交叉限制，P9、P13和P17为HLA-A0201）A1101分子交叉限制，P6和P23为HLA-A0201、A2402分子交叉限制，P19、P21、P24和P25为HLA-A1101和A2402分子交叉限制，并且部分多肽对交叉限制的HLA-A等位基因PBMC有更强的刺激活性，如虚拟预测显示由A0201限制的P5对A2402患者PBMC 的刺激反应明显强于对A0201患者,P9也有类似现象（5）（
如表2所示，根据多肽对不同HLA-A等位基因患者PBMC的刺强弱进行排序，总种HLA-A分子的HBV抗原T细胞表，其中HLA A0201的13种，A1101的16种，A2402的11种。3种HLA A子的表位肽刺激PBMC的斑点数进行非方检验% A1101子与A0201分子比，各种多肽刺激的斑点数明少（P=0.010）；A1101子与A2402子相比，斑点数也明显减少（P=0.026）；A0201与A2402子之间各种多肽的斑点数无（P= 0.533）（果说明A1101子
的HBV表的原明弱
A0201
赵晨，等.HLA-A0201)A5505和A2402限制性HBV抗原肽的虚拟预测与实验鉴定-993-
A P3P6P2P8P4P5Pl P9阳性对照
阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照
A.IPN-ELISPOT方法鉴定HLA-A0201分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点图;
B.检测孔与照孔斑点数统计图;
C.检测孔与照孔斑点数比值(P/N)统计
图2HLA-A020l分子限制的HBV抗原T细胞表位肽
A P15P16P13P14Pll P17阳性对照
阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照
A.IPN-ELISPOT方法鉴定HLA-A1101分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点图;
B.检测孔与照孔斑点数统计图;
C.检测孔与照孔斑点数比值(P/N)统计
图3HLA-All0l分子限制的HBV抗原T细胞表位肽
A2402分子的表位肽，HLA-A5505FE
者体内的HBV CTL细胞弱于HLA-A0201和A2402患者。
3讨论
本研究鉴定获得25种HBV抗原T细胞表位肽，其中55种未见报道。泛认可的表数据库，筛选的表行细胞实验，果大多数虚拟的表
原性，说明拟选的可信度较高，可以继其他HLA分子表的，但经数据库的并代表表的
原性
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