Folin—Ciocalteu法测定昭通葡萄及其葡萄酒总酚含量
家酿葡萄酒作者：袁晓春 李辅碧
来源：《安徽农业科学》2014年第33期
摘要 [目的] Folin-Ciocalteu法测定葡萄总酚含量，为昭通葡萄生产及其酿制工艺提供科学依据。[方法] 采用甲醇作溶剂，超声提取葡萄总酚，以Folin-Ciocalteu试剂和50 g/L Na2CO3溶液处理，在765 nm处测其吸光度。 [结果] 以没食子酸为标准，质量浓度在1～40 mg/L范围内与吸光度线性关系良好（r=0.999 5）。平行测定（n=6）葡萄总酚含量，RSD在1.1%～1.6%，对葡萄和葡萄酒的加标回收率试验结果分别为98.8%、98.3%，RSD依次为1.8%、2.0%。 [结论] 该法操作简便，重复性好，结果准确可靠，可用于测定葡萄及葡萄酒中总酚含量。
关键词 昭通葡萄;Folin-Ciocalteu法;测定;总酚
中图分类号 S663.1 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）33-11859-02
Measure of Total Polyphenols Content in Zhaotong Grape and Grape Wine by Folin-Ciocalteu Method
YUAN Xiao-chun1， LI Fu-bi2 （1. Zhaotong University， Zhaotong，Yunnan 657000; 2. Food and Drug Inspection Office in Zhaotong City， Zhaotong， Yunnan 657000）
Abstract [Objective] In order to provide scientific basis for production and brewing of Vitis vinifera in Zhaotong， the total polyphenol content in grapes was measured by Folin-Ciocalteu method. [Method] Using methyl alcohol as the solvent， total polyphenols of Vitis vinifera was extracted by supersonic method， then added Folin-Ciocalteu reagent and 50 g/L Na2CO3 solution， and measured the absorbancy at 765 nm. [Result] Basing on gallic acid， the mass concentration had an obvious linear relation （r=0.999 5） with absorbancy within the scope of 1-40 mg/L. The parallel determination （n=6） of total polyphenol results were that， when RSD was between 1.1% to 1.6%， the adding standard recovery of Vitis vinifera and grapes wine were 98.8%， 98.3%， RSD 1.8%， 2.
0%. [Conclusion] This method is convenient， repeatable and faithful， which can be used for determination of polyphenol in grapes and grape wine.
Key words Zhaotong grape; Folin-Ciocalteu assay; Determination; Total polyphenol
作者简介 袁晓春（1968- ），女，云南威信人，讲师，从事物质成分分析及其应用的研究。
收稿日期 2014-10-17
植物多酚（Plant polyphenol）又名植物单宁（Vegetable tannin），为植物体内的复杂酚类次生代谢物，具有多元酚结构，主要存在于植物的皮、根、叶、果中。植物多酚具有很强的抗氧化和清除自由基活性，水果、蔬菜、饮料等是植物多酚的主要来源[1]。因为果实汁多味美并含有丰富营养，而倍受人们青睐的葡萄[2]中就含有大量的多酚类物质。葡萄多酚是一种植物多酚类活性物质，能溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，它广泛存在于葡萄籽、葡萄皮与果汁中。葡萄多酚由表儿茶酸等酚酸类、黄烷醇类、花苷类、黄酮醇类和缩聚单宁等物质组成[3]。研究表明，葡萄中的多酚含量对葡萄酒的酿制影响很大。葡萄酒存放
时多酚的各种化学反应将影响到葡萄酒的泽、口感、品质。在葡萄酒酿制和葡萄多酚提取中，都要对多酚含量进行监控和测定。采用Folin-Ciocalteu法测定葡萄多酚具有很好的精密度和准确度[4]。
葡萄和葡萄酒中所含多酚可以消除人体内的自由基而起到抗氧化、抗肿瘤、抗癌、降血脂、预防动脉粥样硬化和冠心病等保健作用，因而深受人们喜爱。生活在云南昭通的人们除了喜欢食用新鲜葡萄，好多家庭还在本土葡萄大量上市的时候，选择新鲜葡萄自行酿制葡萄酒[5]。为此，笔者对昭通葡萄及其家酿葡萄酒进行采样，通过超声提取技术，采用Folin-Ciocalteu法测定其葡萄总酚量，以期为昭通葡萄的生产及其葡萄酒的酿制工艺提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原材料。从市场购进昭通本土出产的不同品种的新鲜葡萄，在不同家庭采集以昭通葡萄为原料的家酿葡萄酒。
1.1.2 主要试剂。
Folin-Ciocalteu试剂，上海荔达生物科技有限公司（分析纯 20140806）;无水碳酸钠，分析纯，天津化学试剂三厂;甲醇，谱纯Fisher Scientific公司;没食子酸标准品，中国食品药品检定研究院，110831-201204;水，超纯水。
1.1.3 主要仪器。GZX-9246MBE数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备;MS105DU电子天平，梅特勒-托利多公司; UC-7100S超声波清洗器，美瑞泰克科技（天津）有限公司;TG16-WS台式高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司; UV-2550紫外可见分光光度计，日本岛津公司。
1.2 方法
1.2.1 试剂的配制。
50.0 mg/L标准溶液：准确称取5.0 mg没食子酸标准品溶解于8.0 ml的甲醇中，并用超纯水定容至100 ml（现配）。50 g/L Na2CO3溶液：称取50.00 g无水Na2CO3，溶于超纯水并定容至1 000 ml。80%甲醇溶液：量取80 ml 甲醇，加12 mol/L的盐酸0.1 ml ，并用超纯水
稀释定容至100 ml[6]。
1.2.2 试样的准备。将2种新鲜葡萄的葡萄皮1号、2号，于40 ℃下烘80 min后冷却备用。采集3个家庭以昭通葡萄为原料的家酿葡萄酒3号、4号、5号（酿制年份、保存条件不详）。
1.2.3 显时间的确定。准确吸取50.0 mg/L没食子酸标准溶液0.50 ml于25 ml比管中，加入80%甲醇溶液0.50 ml、1.00 ml Folin-Ciocalteu试剂、50 g/L Na2CO3溶液8.00 ml，充分摇匀，在15、30、45、60 min处测其吸光度，在15～45 min的吸光度逐渐增大，45 min后吸光度有所降低。以此确定测定反应的显时间为45 min。
1.2.4 总酚的提取。准确称取0.050 g已烘干的葡萄皮，置于5.0 ml 80% 甲醇溶液中，在40 ℃、40 kHz超声提取40 min后，在4 000 r/min下离心20 min后分离出上层清液，同等条件下提取2次，合并提取液，用超纯水稀释并定容至100 ml。
对于家酿葡萄酒，直接吸取1.0 ml于100 ml容量瓶中，加8.0 ml 甲醇并用超纯水定容。
2 结果与分析
2.1 工作曲线的绘制
准确吸取50.0 mg/L没食子酸标准溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 ml分别于7支25 ml比管中，依次加入80%甲醇溶液1.00、0.90、0.80、0.70、0.60、0.40、0.20 ml。测样品时，吸取试液1.00 ml。然后加入1.00 ml Folin-Ciocalteu试剂，充分振荡后，依次加入50 g/L Na2CO3溶液溶液8.00 ml，充分摇匀，45 min后，于25 ℃下，在765 nm处测其吸光度，以吸光度对没食子酸标准溶液的质量浓度作图，酚含量在1～40 mg/L范围内与吸光度呈良好的线性关系，线性计算公式y=0.015 9x-0.002 5，r=0.999 5。
2.2 总酚量测定结果
按照“2.1”分析步骤，对葡萄皮试液1号、2号和家酿葡萄酒3号、4号、5号试液各进行6次平行测定，葡萄皮总酚含量计算公式：葡萄皮总酚含量（mg/g）=xVn/ms，其中x=（y+0.002 5）/0.015 9（mg/L），V=0.001 L，n=100（稀释倍数），ms为葡萄皮试样的质量;葡萄酒总酚含量计算公式：葡萄酒总酚含量（mg/L）=nx，x=（y+0.002 5）/0.015 9（mg/L），n=100（稀释倍数）[7]。葡萄皮和家酿葡萄酒总酚含量测定结果见表1和表2。
由表1、2可见，平行测定样品总酚含量的RSD在1.1%～1.6%，说明该方法具有较好的精密度。
表1 葡萄皮总酚量测定结果
表2 家酿葡萄酒总酚量测定结果
2.3 回收率试验结果
利用“2.2”节的分析结果，分别按1号葡萄皮试液总酚含量的63.3%、94.9%、126.6%和3号家酿葡萄酒试液总酚含量的65.8%、98.7%、131.6%，添加50.0 mg/L没食子酸标准溶液，各平行试验3次，测定其总酚含量，并计算回收率。试验结果见表3，可见该方法具有较好的回收效果。
表3 回收率试验结果
3 结论与讨论
以Folin-Ciocalteu 法测定昭通葡萄及其家酿葡萄酒的总酚含量。选用50.0 mg/L没食子
酸溶液为标准，其质量浓度在1～40 mg/L范围内与吸光度呈良好的线性关系（y=0.015 9x-0.002 5，r=0.999 5）。准确称取40 ℃下烘干葡萄皮0.050 g，采用80%甲醇溶液作为溶剂，在40 ℃、40 kHz超声提取昭通葡萄皮总酚。移取1.00 ml试液，以1.00 ml Folin-Ciocalteu试剂和8.00 ml 50 g/L Na2CO3溶液处理，显45 min后，在765 nm处测定葡萄皮和家酿葡萄酒试液的吸光度。平行测定（n=6）总酚含量RSD在1.1%～1.6%。对葡萄皮和葡萄酒试液进行加标回收率试验的平均回收率分别为98.8%、98.3%，RSD分别为1.8%、2.0%。该法操作简便，具有较好的精密度，重复性好。
2种品种的市售昭通葡萄总酚含量有一定的差别，可能是因为购进的葡萄品种不一样，再加上葡萄的种植方式和生长周期可能也不相同等因素所致。昭通葡萄总酚含量的高低具体受哪些因素影响及其如何影响的问题，还待进一步研究。3种家庭酿制的葡萄酒总酚含量差别较大，可能是因为各个家庭酿制葡萄酒时选用了不同品种的昭通葡萄、采用了
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