(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书 家族名字 | ||
(10)申请公布号 CN 1222578 A (43)申请公布日 1999.07.14 | ||
(21)申请号 CN98120233.0
(22)申请日 1998.10.06
(71)申请人 中国农业科学院生物技术研究中心
地址 100081 北京市海淀区白石桥路30号
(72)发明人 郭三堆
(74)专利代理机构
代理人
(51)Int.CI
C12N15/29
C12N15/63
C12N15/82
A01H1/00
权利要求说明书 说明书 幅图 |
(54)发明名称
合成编码雪花莲凝集素的抗同翅目害虫基因及其应用 | |
(57)摘要
本发明提供了人工合成的编码雪花莲凝集素的基因。涉及包含所说基因的融合基因构建体,携带该构建体的新的重组表达载体。该表达载体具有在普通植物中高效表达的特性。还涉及被所说的表达载体转化的植物细胞,以及由所说的转化细胞产生的对害虫,尤其是对同翅目害虫表现有杀虫性的转基因植物及其后代,包括植物种子及植物组织。本发明尤其涉及了抗蚜虫转基因棉花。 | |
法律状态
法律状态公告日 | 法律状态信息 | 法律状态 |
权 利 要 求 说 明 书
1．合成的编码雪花莲凝集素杀虫蛋白质或其部分的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列及其功能等同序列。
2．根据权利要求1的核苷酸序列，特征在于其编码具有如SEQ ID NO:2所示的雪花莲凝集素的氨基酸序列或其部分及其功能等同蛋白质。
3．根据权利要求1的核苷酸序列，其功能等同序列符合SEQ ID NO:3所示核苷酸序列或其部分。
4．根据权利要求1至3中任一项的核苷酸序列，特征在于其基本上是由适合于在普通植物细胞中表达的优化密码子组成的。
5．适于在植物细胞中表达权利要求1的核苷酸序列的融合植物表达载体。
6．根据权利要求5的融合植物表达载体，其中包含的雪花莲凝集素基因表达盒包含：
a)．5′端非编码区
b)．根据权利要求1～4的核苷酸序列
c)．3′端非编码区
7．根据权利要求6的融合植物表达载体，其中a)所说的5′端非编码区由两个增强子序列，一个启动子序列，一个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列，和一个编码核糖体结合蛋白的序列组成。
8．根据权利要求7的5′端非编码区，其中所说的带有加倍的增强子元件的CaMV 35S启动子序列具有如SEQ ID NO:13的核苷酸序列或其功能等同序列。
9．根据权利要求7的5′端非编码区，其中所说的翻译增强序列是Ω序列和Kozak序列，具有如SEQ·ID NO:12的核苷酸序列或其功能等同序列。
10．根据权利要求6的雪花莲凝集素基因表达盒，其中c)中所说的3′端非编码区包含一个多联终止子序列，具有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列或其功能等同序列。一个融合基因转录产物的切割序列和一个融合基因转录产物的加工序列，具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序或其功能等同序列。
11．可构建在植物表达载体中并在植物细胞或整株植物中表达雪花莲凝集素的基因表达盒，其具有保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.0363的携带于大肠杆菌DH5α中的重组载体pG4AS8的特征。
12．产生对同翅目害虫有杀虫性的植物的方法，该方法包括：
1)．构建所说的如权利要求5至10所描述的融合植物表达载体；
2)．用任何一种可行方法将步骤1)中得到的融合植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得对害虫有抗性或杀伤能力的转基因植物及其后代，包括种子和任何部分的植物组织。
13．根据权利要求12的方法，其中所说的植物是可表达权利要求5的融合植物表达载体的任何一种植物。
14．根据权利要求12的方法，其中所说的植物是棉花。
说 明 书
本发明涉及人工合成的编码雪花莲凝集素的基因，包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化的植物细胞，以及由所说的细胞产生的对害虫，尤其是对同翅目害虫表现有杀虫性的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。
近年来在抗虫植物基因工程研究领域，有关凝集素的研究逐渐引起了科学家们的重视。一般说来，凝集素是一类可逆的结合特异单糖或寡糖的蛋白质，部分具有杀虫作用。凝集素早期的定义“lectin”来源于拉丁文“legere”，意思是选择，以强调其能选择性地与糖复合物相结合的特性。后来由于lectin被广泛应用于表现出更广泛凝集行为的所有蛋白质，故“lectin”已失去早期选择的意思，而另一个名字“agglutinin”作为lectin的同义词，能更准确地反映这类蛋白质的特性，因为它是指能通过与细胞表面结合碳水化合物的特异性结合而使细胞凝集的所有蛋白质。由于植物凝集素家族成员的增加，对其结构、功能研究的深入以及分子生物学水平上
新的发现，使得植物凝集素的定义几经修正。最近Peumans和Van Damme(Plant Physiology,109:347～352,1995)认为凝集素(lectin)的定义应为：含有至少一个非催化结构域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的蛋白质总称。
关于凝集素的杀虫机理，目前一般认为外源凝集素进入昆虫消化道后，与肠道围食膜细胞表面的糖蛋白结合，降低膜的通透性，从而影响营养物质的正常吸收。此外，这种结合还可能在昆虫的消化道内诱发病灶，引起消化道内细菌和病毒的繁殖等，从而对昆虫本身造成危害(Eisemann C.H.,et al.Entomologia Experimental etApplicata.72:1～10,1994)。
雪花莲凝集素(Galanthus Nivalis Agglutinin,以下均简称GNA)是石蒜科(Amaryllidaceae)的一种名为雪花莲的植物体内存在的一种植物凝集素。Van Damme等人(Planta Vol 186:35～43,1991；European Journal of Biochemistry Vol 202:23～30,1991)发现GNA是由多基因家族编码的。它的杀虫效果较好，对具有刺吸式口器的害虫如蚜虫、稻飞虱、叶蝉等具有较好抗性，对咀嚼式害虫也具有中等抗性。另外由于GNA只专一识别并结合α-1,3和α-1,6甘露糖(Van Damme Els J.M.,etc.FEBS Letters.Vol215:140～144,1987)，而人及绝大多数动物细胞表面甘露糖残基很少，所以GNA对人畜几乎无害。是目前所知的最适于转基因植物研究的植物凝集素之一。
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