血站核酸检测工作导则(2016年版)
血站核酸检测工作导则
一、核酸检测技术用于血液筛查概述
1.筛查项目
目前用于血液筛查的核酸检测项目包括：人类免疫缺陷病毒核糖核酸（Human Immunodeficiency VirusRibonucleic Acid, HIV RNA）、丙型肝炎病毒核糖核酸（Hepatitis C Virus Ribonucleic Acid,HCV RNA）和乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（Hepatitis B Virus Deoxyribonucleic acid,HBV DNA）。
2.检测方式
核酸检测技术（NAT）筛查可通过两种方式进行：单人份检测（IDT）和混合样本检测（Pooled Testing）。
混合样本检测方法是先将献血者样本进行不多于8人份混合，然后进行核酸分离纯化和扩增检测。对于反应性的混合样本再进行拆分检测，若拆分出反应性样本（可为一个或多个），则呈反应性反应的血液进入隔离程序；呈阴性反应的血液可进入合格放行程序；如全部样本检测结果均为阴性，则全部血液均可进入合格放行程序。
混合样本检测模式宜在进行血清学检测后，将血清学检测阴性的样本进行混合样本检测。
单人份检测模式，是对单个样本进行检测的模式，其中对单个样本同时三个项目的检测而无法区分反应性项目的检测称为联合检测。对于反应性的样本可进行鉴别试验以确定结果。对于联检阳性样本不需等待鉴别结果，可以直接进入血液的隔离程序。
3.应用原则
实验室的检测策略应该以有效保证阳性样本的检出为目的。与血清学抗原抗体检测相结合才能真正起到提高血液安全性的作用，核酸检测对于早期感染的检测效果与当地的流行病学状况和献血人是相关的，因此在选择检测体系与检测模式时应从检测通量、检测系统性能、检测成本、献血人流行状况、业务工作流程等几个方面进行综合分析，选择适合的检测模式。
二、检测技术人员要求
1.人员的配备与资质
应有与核酸检测业务相适应的岗位设置和人员配备，满足从血液样本采集、接收到实验室报告发出的整个核酸检测过程及其支持保障等需求。
血站核酸检测实验室人员资质应至少满足《血站质量管理规范》和《血站实验室质量管理规范》关于人员的要求，并经过省级以上卫生计生行政部门组织或认可的核酸检测相关的理论和技术培训考核合格。
2.岗位设置与职责
实验室岗位的设置应根据核酸检测的技术要求及血站的检测策略来决定，应有足够的人力资源以满足工作的需求及履行质量体系相关的职责。应具有明确的岗位说明，以明确各个岗位的职责和需要达到的标准。实验室管理层应对各个岗位的操作人员实施授权。
3.人员培训及能力评估
1）培训：符合资质的核酸检测技术人员还要接受实验室生物安全以及厂家的上岗前仪器设备操作、维护及校准等的培训。技术培训内容应覆盖工作人员所涉及的所有工作范畴，培训的评估结果是确定人员是否适合其岗位的依据。
2）能力评估：实验室应建立操作人员能力评估机制。每年至少实施一次人员的能力评估，以评估其血液核酸检测工作的胜任程度。参照评估结果制定人员持续培训计划。操作人员的操作误差分析、检测过程变更可作为培训需求纳入培训活动，需记录人员的能力评估过程。
三、实验室建筑、环境与设施
1.基本原则
根据核酸检测的特点，以防止实验室交叉污染为目的，实施实验区域划分和空气流向、环境温湿度的控制。生物安全等防护设施、噪音控制等应以保证检测样本的安全和操作人员的健康为原则。
2.分区及功能要求
1）分区原则：核酸检测实验室原则上应设置4个独立的工作区域: 试剂耗材储存和准备区、样本处理区、样本制备区（核酸纯化）和扩增检测区，4个区域空间上完全相互独立，处于分隔状态。区域之间不能直接相通，需有缓冲区。
a)试剂耗材储存和准备区：该区必须独立设置。用于试剂的制备、分装和扩增反应混合液的准备以及离心管、吸头等耗材的贮存和准备。贮存试剂和用于样本制备的耗材等材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过扩增检测区。试剂盒中的阳性对照品及质控品不能保存在该区，应保存在样本处理区。
b)样本处理区：核酸纯化前样本的保存、样本的开盖和混合；如果采用样本混合和核酸纯化为一体的设备，该区可以和样本制备区合并。
c)样本制备（核酸纯化）区：进行核酸（RNA、DNA）提取和纯化、贮存及核酸模板加入至扩增反应管。
d)扩增检测区（扩增后区域）：cDNA合成、DNA扩增及检测。
2）适当合并原则：采用样本汇集及核酸纯化一体的设备，可以将样本处理区b）、样本制备区c）进行合并。核酸纯化及扩增检测为一体的全自动分析仪，可将样本制备区c)、扩增检测区d)合并。不需做混样检测，且核酸纯化检测为一体的的检测系统可将b）、c)、d)3个区域合并。
3)样本接收区域样本接收区域应与核酸实验室样本处理区域分开，以免过多人员进入样本处理区域造成污染。
3.通风系统
实验室的空气流向可按照从试剂耗材储存和准备区→样本处理区→样本制备区→扩增检测区的方向，以空气压力递减的方式，实施空气流向控制。防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。
扩增前和扩增后区域应具有独立通风系统。建议扩增后区域保持负压状态。其它区域保持正压或常压状态。
4.实验室环境温度湿度的控制
根据设备的运行要求确定温度湿度的允许及波动范围，实验室应有保证相应环境温度和湿度的设施，以满足试验过程和检测系统的要求，同时应监控并记录实验室温度和湿度。
5.电源
实验室应配备UPS电源，以保证核酸检测工作正常进行。
6.限制进入
核酸检测实验室应有限制进入的要求，非授权人员不得进入核酸检测实验室。
7.清洁、消毒及环境监控
实验室应具有清洁、消毒设施，在试验开始前和结束后对实验室地面、实验台面和空气实施清洁和消毒。废弃物需放置在指定位置或容器。可采用消毒设备（紫外灯、臭氧消毒装置）实施空气或相关位置的消毒。
工作人员在进行实验室清洁消毒时，应遵从从清洁区域向污染区域实施消毒的原则。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
每月至少实施暴露表面（包括设备表面、工作台面表面等）有无核酸扩增产物污染的监测。具体见假阳性结果分析部分。
8.安全设施
实验室应配备数量充足、布局合理的照明、消防器具、可用的逃生通道和应急处理设施，如紧急喷淋和洗眼装置。为操作者提供良好的操作环境，将发生伤害及职业暴露的风险降至最低。
四、检测系统的确认、运行与维护
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1.基本要求
血站开展核酸检测时，除应配备满足检测工作需要的核酸检测系统、信息系统（包括硬件和软件）等关键设备，还应配备离心机、冷藏冷冻设备满足样本采集、处理和保存的工作要求。集中化检测的实验室的设备配备与信息系统应能满足其工作需要。实验室需保存关键设备管理相关记录。核酸检测系统包括核酸混样（混样检测模式）设备、纯化设备、核酸扩增检测设备、配套的信息系统及配套的试剂和耗材。
2.检测系统的确认
实验室必须实施核酸检测系统的确认活动。确认活动包括检测系统购置前的设计确认，使用前的安装确认、运行确认和性能确认，检测系统使用后的性能监控及再确认。除应提供厂商的安装确认报告之外，实验室还应对每个检测系统进行分析灵敏度验证。
3.检测系统的使用和维护
实验室需依据设备厂家说明书或操作手册，建立有可操作性的设备标准操作规程。操作规程需定期评审，以适应检测过程的变化。
实验室需建立设备维护计划和维护程序，明确设备维护分级、周期及职责，采用监控指标监控设备的维护效果，使设备始终处于在控状态。设备的维护内容应包括日维护、周维护、月维护和视需要进行的维护。同时应建立检测系统回顾性评价指标，包括初筛阳性率（混检或联检阳性率）、鉴别阳性率、拆分阳性率等。
4.设备故障
设备故障时，应停止使用，并清楚标记防止误用。设备故障后，应首先分析故障原因，如果设备故障可能影响了方法学性能，故障修复后的设备应经校准、验证或检测等方式表明其达到规定的可接受标准后方可使用。实验室应检查上述故障对之前检验的影响，必要时对之前的数据进行评估和验证，并确认维修后的设备运行情况。实验室应采取合理措施在设备投入使用、修理或退役之前对其去污染。
5.设备运行的安全问题
应维持设备处于安全工作状态，包括检查电气安全、紧急停止装置、以及化学和生物材料。只要适用，应使用制造商提供的规格说明和/或使用说明。应将所采取降低污染措施的内容清单提供给使用该设备工作人员。实验室应留出合适的空间以供设备修理和放置适当的个人防护装备。
6.设备的校准
实验室需校准或验证的设备，应由具备合格资质的技术人员完成，校准后的设备应贴标签或以其他编码标示设备的校准或验证状态，并标明再次校准或再次验证的日期。
7.试剂和耗材
试剂和耗材的选择和采购应遵循血站相应的管理制度，同时满足核酸检测样本采集、检测的质量要求。
1）试剂耗材的质量检测：接收试剂耗材时应首先确认其包装是否完整、标识是否清晰、运送状态是否符合要求。在开封后应注意观察试剂耗材有无破损或条码不清晰等现象。样本汇集管、核酸提取纯化和扩增检测使用的消耗品如为非核酸检测试剂厂商提供时，应每批进行有无干扰物的实验。
2）试剂耗材的使用和保存：试剂和耗材应保存在试剂耗材储存和准备区。在经过质检后的试剂可将试剂盒内的阳性对照和质控品放置于样本混样处理区的冰箱内，使用前应核对试剂耗材的规格、批号，按相应的标准操作规程进行操作并作相应记录，按照先进先出的原则，不同批号的试剂不得混用。
五、样本的采集与管理
1.样本的采集
1）采血管要求：应使用适用于核酸检测，带分离胶的真空采血管，无菌、无DNA酶、无RNA酶，样本为血清或者血浆（EDTA 或者枸橼酸盐抗凝），宜采用含惰性分离胶的EDTAK2真空采血管留取。应有采血管质量要求，规定储存条件，包括出库前及出库后（献血场所）的保存条件。
2）样本的采集量：用于核酸检测的样本，样本量对检测非常重要。不同实验室所使用的检测系统不同，对样本量的要求也会有所不同。在确定采血量时应考虑如下因素：混样联合检测或者单人份联合核酸检测中，需进行样本鉴别试验或拆分试验；仪器故障等意外原因，需要重新检测；以及对献血者感染状况进行进一步评估的检测，如DNA或者RNA定量及乙肝五项指标检测等。
3）样本采集：应制定静脉穿刺和血液采集标准操作规程，严格采用无菌操作技术进行静脉穿刺。留样时用针头刺穿试管密封塞，按照采血管标注的留取量

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