细胞P300/CBP组蛋白乙酰转移酶（P300/CBP-HAT）活性光度法（340nm）
定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
细胞P300/CBP组蛋白乙酰转移酶（P300/CBP-HAT）活性光度法（340nm）定量检测试剂是一种旨在通过通用底物H3多肽，在敏感性抑制剂存在与否的情况下，通过P300/CBP的作用，将乙酰辅酶A上的乙酰基团，转移到多肽分子上的过程中，释放出巯基辅酶A，进而使用α-酮戊二酸脱氢酶反应系统中伴随的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的还原反应， 即采用光度法测定其还原后峰值的变化，来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、核蛋白样品、部分或完全纯化酶样品中P300/CBP HAT的特异活性检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
核小体（nucleosome）是染质的最小结构单位，由组蛋白H2A-H2B双体和H3-H4双体构成
的组蛋白八体结构（octamer），外层涵盖146碱基DNA。其结构中组蛋白N末端为游离状态，且高度进化保留，在特定氨基酸部位发生诸如甲基化、乙酰化、磷酸化修饰，以改变其电荷和功能。组蛋白上特定赖氨酸残基的ε氨基基团的乙酰化通过组蛋白乙酰转移酶（Histone Acetyltransferase；HAT；EC2.3.1.48）催化产生，具有表观遗传学的调节作用，达到染体重构（remodeling），染质松弛打开，促使基因转录。其功能异常将导致肿瘤、神经退行性疾病、AIDS和炎症。组蛋白乙酰转移酶，又称为赖氨酸乙酰转移酶（lysine acetyltransferase）；KAT），分成二型，细胞核内的A型，包括P300/CBP、Gcn5、TAFII250等，和细胞浆内的B型，例如Hat1。其又分成六类：P300/CBP（P300/cAMP Responsive Element-Binding Protein），包括P300、CBP等；GNAT（Gcn5-related N-acetyltransferase），包括Gcn5、PCAF、Hat1、Elp3、Hpa2、Hpa3、ATF-2、Nut1等；MYST（MOZ、ybf2/sas3、sas2、Tip60），还包括Esa1、MOF、MORF、HBO1等；核受体共激活因子（nuclear receptor co-activator），包括SRC-1、SRC-3、ACTR、TIF2；TAFII250（TATA box binding protein associated factor）；TFIIIC（transcriptional factor IIIC）等。其中P300/CBP家属中包括P300、CBP、和P300/CBP相关因子（P300/CBP Associated Factor；PCAF），这是第一个发现的组蛋白乙酰转移酶，成为结构、机制和功
能研究的代表。P300（又称为KAT3B），E1A肿瘤结合蛋白和CBP（又称为KAT3A），cAMP反应元素结合蛋白（cAMP Responsive Element-Binding Protein；CREB）是全面性转录共激活因子（global transcription coactivator），位于核内，属于旁系同源（paralogue）蛋白，功能相等，序列相似，相同的结构域（包括核受体结合结构域、锌指（zinc finger）结构域、溴区结构域（bromodomain）、内部大乙酰转移酶结构域等），具有内生性乙酰转移酶活性，乙酰化组蛋白和非组蛋白，与300多个DNA结合性转录因子、病毒转化因子、核受体、信号分子等反应、其功能在于调节细胞周期和细胞分化、控制细胞生长和凋亡、整合多种转录水平信号依赖性通路（例如G蛋白通路）、修正基因表达、DNA修复和复制、蛋白间反应和蛋白稳定性，作用于胚胎发育尤其是器官生成，以及调节造血干细胞、神经突触活性和长期记忆形成等。P300和CBP异常，会导致肿瘤发生和发展、糖尿病、哮喘、髓细胞白血病（myeloid cell leukemia）、阔拇指巨趾综合征（Rubinstein-Taybi syndrome）。基于底物H3组蛋白多肽Ac-Gln-Thr-Ala-Arg-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly-Lys-Ala- Pro-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Thr- Lys-NH2 （H3组蛋白N末端5至23氨基酸残基），在P300/CBP敏感性抑制剂C646存在与否的情况下，通过P300/CBP的作用，将乙酰辅酶A上的乙酰基团，转移到多肽分子上，由此产生乙酰化多肽和巯基辅酶A（CoA-SH），进而通过α-
酮戊二酸脱氢酶（α-ketoglutarate dehydrogenase）反应系统中，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）还原为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析P300/CBP组蛋白乙酰转移酶的特异活性。其反应系统为：
产品内容
裂解液（Reagent A） 毫升
分离液（Reagent B） 毫升
清理液（Reagent C） 毫升
萃取液（Reagent D） 毫升
缓冲液（Reagent E） 毫升
反应液（Reagent F） 微升
底物液（Reagent G） 微升
专性液（Reagent H） 微升
阴性液（Reagent I） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存 反应液（Reagent F）、 底物液（Reagent G）和 专性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月
用户自备
磷酸盐缓冲溶液（PBS）：用于清洗细胞样品
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
96孔板或200微升1厘米光径比皿：用于反应和光度分析的容器
酶标仪或分光光度仪：用于光度分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、样品准备
1． 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
2． 小心抽去培养液
3． 小心加入10毫升用户自备的磷酸盐缓冲溶液（PBS），覆盖生长表面
4． 小心抽去清理液
5． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
6． 加入xx毫升 裂解液（Reagent A），混匀细胞
7． 移入到预冷的15毫升锥形离心管
8． 强力涡旋震荡10秒
9． 置于冰槽里孵育15分钟
10． 加入xx毫升预冷的 分离液（Reagent B），混匀
11． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1300g
12． 小心抽去上清液
13． 加入xx毫升预冷的 清理液（Reagent C）
14． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1300g
15． 小心抽去上清液
16． 小心加入xx微升预冷的 萃取液（Reagent D），混匀
17． 转移到新的预冷的1.5毫升离心管
18． 超声处理30秒：功率100瓦，10秒一次，间隔2分钟，重复2次（注意：保持在冰槽里）
19． 置于冰槽里孵育30分钟
20． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）
21． 小心移取上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
22． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
23． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如核蛋白或纯化酶样品等），置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长340nm，间隔2分钟，读数6次（共10分钟），并置零
3． 缓冲液（Reagent E）置于室温下均衡温度
三、 样品总活性测定
1． 加入xx微升 缓冲液（Reagent E）到新的比皿
2． 加入xx微升 反应液（Reagent F）
3． 加入xx微升 底物液（hpb300Reagent G）
4． 在30℃温度下孵育3分钟
5． 加入xx微升 阴性液（Reagent I）
6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7． 即刻放进分光光度仪检测，获得背景读数（10分钟读数－0分钟读数）
四、 样品总活性测定
1． 加入xx微升 缓冲液（Reagent E）到新的比皿
2． 加入xx微升 反应液（Reagent F）
3． 加入xx微升 底物液（Reagent G）
4． 在30℃温度下孵育3分钟
5． 加入10微升待测样品（注意：50微克核蛋白；样品须清澈）
6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7． 即刻放进分光光度仪检测，获得样品总活性读数（10分钟读数－0分钟读数）
五、 样品非特异活性测定
1． 加入xx微升 缓冲液（Reagent E）到新的比皿
2． 加入xx微升 反应液（Reagent F）
3． 加入xx微升 底物液（Reagent G）
4． 加入xx微升 专性液（Reagent H）
5． 在30℃温度下孵育3分钟
6． 加入10微升待测样品（注意：50微克核蛋白；样品须清澈）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，获得样品非特异活性读数（10分钟读数－0分钟读数）
六、 计算样品实际活性
1） 总活性和非特异活性
2） 样品特异活性
注意事项
1． 本产品为20次操作，包括背景对照
2． 操作时，须戴手套
3． 样品须澄清，至关重要
4． 样品处理时，避免使用巯基乙醇、DTT等
5． 孵育反应完成后即刻进行光度测定
6． 测定值由低到高变化
7． 测定值读数越高，表明酶活性越高
8． 光度测定后，比皿须清洗彻底
9． 待测样本为核蛋白样品，其蛋白浓度为50微克/10微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
11． P300/CBP组蛋白乙酰转移酶单位活性定义为：在30℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够还原1微摩尔NAD所需的酶量作为一个活性单位
12． 本公司提供系列组蛋白乙酰转移酶检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感
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