陆地棉转化事件18C006-10-13及其特异性鉴定方法
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(10)申请公布号 CN 110106198 A
(43)申请公布日 2019.08.09
(21)申请号 CN201811416535.1
(22)申请日 2018.11.26
(71)申请人 中国农业科学院棉花研究所
    地址 455000 河南省安阳市开发区黄河大道38号
(72)发明人 李付广 秦文强 王鹏 杨召恩 葛晓阳 杨作仁 于娅 王晔 鲁丽丽 胡伟 王玉芬
(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限公司
    代理人 关畅
(51)Int.CI
     
                                                                  权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
      陆地棉转化事件18C006-10-13及其特异性鉴定方法
(57)摘要
      本发明公开了陆地棉转化事件18C006‑10‑13及其特异性鉴定方法。本发明将Cry51Aa1.C006‑1基因导入陆地棉CCRI24中，使基因在陆地棉CCRI24中过表达，得到转基因棉花，该转基因棉花为将序列1所示的外源DNA片段插入目的棉花基因组第D12号染体的第63328845‑63329028位间，替换掉第D12号染体的第63328845‑63329028位间182bp的碱基序列，得到的棉花。试验证明，该转基因棉花不仅抗盲蝽象方面具有高抗特性，而且株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数和衣分也高于陆地棉CCRI24。本发明为培育具有抗盲蝽象的转基因棉花奠定基础，具有重要的应用价值。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-03-31
授权
发明专利权授予
权 利 要 求 说 明 书
1.一种转基因棉花的培育方法,为将外源DNA片段插入目的棉花基因组第D12号染体的第63328845-63329028位间,替换掉第D12号染体的第63328845-63329028位间182bp的碱基序列,得到转基因棉花;
所述转基因棉花的盲蝽象抗性和/或株高和/或第一果枝长度和/或果枝数和/或结铃数和/或衣分均高于所述目的棉花;所述转基因棉花的单铃重低于所述目的棉花;
所述外源DNA片段为含有Cry51Aa1.C006-1基因的DNA分子。
2.如权利要求1所述的培育方法,其特征在于:所述外源DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
3.用于鉴定植物样品是否来源于权利要求1或2所述培育方法获得的转基因棉花或其后代的方法,包括如下步骤:
检测所述待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A;所述DNA片段A由权利要求1或2中所述外源DNA片段在所述转基因棉花的上游侧翼片段、所述外源DNA片段和所述外源DNA片段在所述转基因棉花的上游侧翼片段组成;
若所述待测植物样品的基因组DNA含有所述DNA片段A,则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代;
若所述待测植物样品的基因组DNA不含有所述DNA片段A,则所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代。
4.如权利要求4所述的方法,其特征在于:所述上游侧翼序列的核苷酸序列如序列表中序列2所示;所述下游侧翼序列的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
5.如权利要求3或4所述的方法,其特征在于:所述“检测所述待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A”的方法为S1)或S2)或S3):
S1)直接测序;
S2)用引物对1和/或引物对2对待测植物样品的基因组DNA进行PCR扩增,然后进行如下判断:若有目的扩增产物,则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代;若没有目的扩增产物,则所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代;
所述引物对1为能够扩增由所述外源DNA片段5’端和紧邻其所述上游侧翼序列部分或全部片段组成的DNA分子甲的引物对;其对应的目的扩增产物为所述DNA分子甲;
所述引物对2为能够扩增含有所述外源DNA片段3’端和紧邻其所述下游侧翼序列的部分或全部组成的DNA分子乙的引物对;其对应的目的扩增产物为所述DNA分子乙;
S3)用能特异结合所述DNA分子甲或所述DNA分子乙的探针对所述待测植物样品的基因组DNA进行Southern杂交,然后进行如下判断:若能得到杂交片段,则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代;若不能得到杂交片段,则所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于:
所述引物对1由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列7所示的单链DNA分子组成;
棉花事件
所述引物对2由序列表中序列6所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成。
7.一种用于鉴定待测植物样品是否来源于权利要求1或2所述培育方法获得的转基因棉花或其后代的试剂盒,包括权利要求5或6中所述引物对1和/或引物对2。
8.一种获得盲蝽象抗性提高和/或株高提高和/或第一果枝长度提高和/或果枝数提高和/或结铃数提高和/或衣分提高和/或单铃重降低的棉花的方法,包括如下步骤:
(1)按照权利要求1或2所述方法获得转基因棉花;
(2)将所述转基因棉花自交或杂交,得到繁育后代,按照权利要求3至6任一所述的方法鉴定所述繁育后代,得到目标植株。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于:所述转基因棉花的种子的保藏编号为CCTCCNO:P201822。
10.D1)-D6)中的任一种:
D1)采用权利要求1或2所述培育方法获得的转基因棉花在棉花育种中的应用;
D2)权利要求1或2中所述外源DNA片段在调控棉花抗盲蝽象中的应用;
D3)权利要求1或2中所述外源DNA片段在调控棉花株高和/或第一果枝长度和/或果枝数和/或结铃数和/或衣分和/或单铃重中的应用;
D4)权利要求1或2中所述外源DNA片段在鉴定待测植物样品是否来源于权利要求1或2所述培育方法获得的转基因棉花或其后代中的应用;
D5)权利要求5或6中所述引物对1和/或引物对2在鉴定待测植物样品是否来源于权利要求1或2所述培育方法获得的转基因棉花或其后代中的应用;
D6)权利要求3或4中所述上游侧翼序列和/或下游侧翼序列在鉴定待测植物样品是否来源于权利要求1或2所述培育方法获得的转基因棉花或其后代中的应用。
说  明  书
<p>技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及陆地棉转化事件18C006-10-13及其特异性鉴定方法。
背景技术
转化事件是由外源基因在基因组插入位点的上下游侧翼区和外源基因构成的分子结构。通常,外源基因转化植物可以得到一个转化体体,这个转化体体包含大量独立的事件,其中每个事件都是独特的。外源基因在植物中的表达受到外源基因所插入的染体位置的影响。这可能源自染质结构或者整合位点附近转录调控元件的影响。相同基因在不同转化事件中的表达水平具有很大的差异,在表达的空间或时间模式上也可能存在差异。而且外源基因的插入也可能会影响内源基因的表达。因此,每个独立转化事件对受体植物的影响都是不同的。获得能有效表达外源基因,同时不影响植株本身农艺性状的植物转化事件在培育转基因作物新品种中具有重要的应用价值。
我国是世界上最大的棉花生产国和消费国,也是最大的纺织品和服装生产国与出口国。棉花总产量占世界棉花产量的25%左右。棉花生产的兴衰,对我国国民经济的发展,乃至人民生活水平的提高都产生着一定的影响。棉花是受害虫危害最为严重的农作物之一,我国棉花害虫至少有300种。在转基因抗虫棉(即抗棉铃虫)培育之前,以棉蚜、棉铃虫、棉叶螨和棉红铃虫四大害虫危害棉花最为严重,每年因虫害造成的棉花产量损失达15%~20%,每年为防治害虫投入的农药费用每公顷高达1200-1800元。随着BT抗虫棉的广泛种植与田间农药用量的大幅度减少,从根本上有效控制了棉铃虫等鳞翅目害虫,但棉田的生态系统随之发生了一系列变化,在棉铃虫的危害得到了有效的防治的同时,棉蚜、盲蝽象、烟粉虱等非靶标害虫数量大幅增加,逐渐上升为棉田的主要害虫,尤其是盲蝽象,对棉花的生产造成了巨大的损失。

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