羊瘤胃乳酸菌的分离鉴定及抗逆性筛选
dohl0.3969/j.issn.2095-3887.2021.02.009
羊瘤胃乳酸菌的分离鉴定及抗逆性筛选
郝贺，朱原，阿合玛尔列•海依拉提，周双，张立伟，石玉祥，张永英
（河北工程大学生命科学与食品工程学院，邯郸056021）
摘要：为开发羊源乳酸菌菌种资源，从健康成年散养山羊瘤胃内容物中分离乳酸菌，经生化试验、基因测序以及同源性分析、构建遗传进化树等方法对分离出的乳酸菌进行鉴定，并通过耐酸和耐胆盐试验筛选抗逆性良好的乳酸菌。结果表明：从散养山羊瘤胃内容物中分离出11株乳酸菌，将其编号为R1~R9、R11和R12；其中R1、R2为杜氏肠球菌，R3、R7为乳酸肠球菌，R4、R5、R6、R8、R9为屎肠球菌，R11为鼠李糖乳杆菌，R12为莱菲氏肠球菌；R4（屎肠球菌JQ067694.1）在pH值为2时存活率超过80%，在0.9%浓度胆盐下，存活率超过30%，抗逆性优于其他菌株，生产应用潜力较好。
关键词：山羊；乳酸菌；抗逆性；16S rDNA；系统发育树
中图分类号:S826.7文献标识码:A文章编号:2095-3887（2021）02-0044-06
Isolation,Identification and Stress Resistance Screening of R umen Lactic Acid Bacteria in Goat
HAO He,ZHU Yuan,Ahemaerli^Haiyilati,ZHOU Shuang,ZHANG Liwei,SHI Yuxiang,ZHANG Yongying
（College of Life Sciences and Food Engineering,Hebei University of Engineering,Handan056021,China）
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Abstract: The purpose of this paper is to develop the resources of lactic acid bacteria from sheep.Lactic acid bacteria were isolated from the rumen contents of healthy adult free-range goats,and the isolated lactic acid bacteria were identified by biochemical test, gene sequencing,homology analysis,construction of genetic evolution tree,and so on.The lactic acid bacteria with good stress resistance were screened by acid tolerance and bile salt tolerance test.The results showed that11strains of lactic acid bacteria were isolated from the rumen contents of free-range goats and numbered as R1-R9,R11and R12.Among them,R1and R2were Enterococci,R3and R7were Enterococci,R4,R5,R6,R8,R9were Enterococcus faecium,R11was Lactobacillus rhamnoides, and R12was Enterococcus Leifei.The survival rate of R4{Enterococcus faecium JQ067694.1)in pH=2was more than80%,and in0.9%concentration of bile salt,the survival rate was more than30%,and the stress resistance was better than other strains, indicating that strain R4had good production and application potential.
Keywords:goat;lactic acid bacteria;stress resistance;16S rDNA;phylogenetic tree
反刍动物传统养殖中，主要以饲喂富含纤维素的青草、秸秆为主，但在集约化养殖的大背景下，往往会搭配精料饲喂。投喂精料过多，损伤反刍动物消化系统，导致胃肠道菌失衡，严重影响反刍家畜的健康和经济效益。一些学者研究表明，反刍动物低蛋白日粮+氨基酸的饲养方式更加合理［1］，饲料蛋白的利用率，降低、的，而且还可低消化系统疾病，但是
收稿日期：2021-01-03
作者简介：1996-）,，研究，研究方为兽医学
通信作者：，女，，研究方向为学粗纤维的适口性较差。青贮饲料在发酵过程中会产生乳酸,&H值降低会抑制病原微生物的繁殖［2］，还可降解少量纤维素，饲料的适口性。酸菌可以促进青ti饲料中化物、、蛋白的，的物巴会一些维生素巴酸菌进入胃肠道还可肠道菌平衡，是动物的蛋白质来源。而且，同源动物的酸菌能更好地适应胃肠道环境定殖和大殖讥
以年养健康为，胃物中酸菌, 学、化、16S
rDNA序列同源性比较和遗传进化分析结果对所得菌株进行种属分类鉴定，并通过耐酸耐胆盐试验筛选出抗逆性较好的乳酸菌，为青贮饲料发酵提供菌种资源。
!材料与方法
1.1材料
1.1.1样品饲喂青草的散养健康成年山羊瘤胃内容物。
1.1.2主要试剂细菌基因组提取试剂盒购于生工生物工程（上海）有，生化发酵购于
试剂有，通物（27F、1492R）由苏州金唯智生物科技有合成。
1.2方法
1.2.1菌株的分离纯化用无菌取瘤胃内容物，用灭菌生理盐水稀释，过滤、去除食物残渣。滤液倍比，分别吸取稀释梯度10-M0-M0-7的滤液100“L于灭菌培养皿中，再加入50!~55!含有3%碳酸钙的MRS培养基，混合，，37!培养48h菌
挑取的菌落，在MRS固体培养基上分离化,37!养48h，观察菌落形态。并进行，观察细菌形态。并4!
1.2.2乳酸菌的生化鉴定按照国家标准（GB4789.35—2010）对菌株进行属的生化鉴定，发酵糖种类为棉
乳
伯糖、山梨醇。挑取纯化养的单个细菌菌落接种于细菌微量生化发酵管中，37!养48h后观察发酵管颜及产气变化，此外还进行接触酶试验冋。对第8版《伯杰氏细菌鉴定手册沪"和1见细菌系统鉴定手册沪"，判定菌株的种属。
1.2.3乳酸菌的分子生物学鉴定
1.2.3.1细菌基因组的提取细菌基因组提取试剂盒说明书操作，提取菌株DNA。
1.2.3.216SrDNAPCR扩增及测序以基因组DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物27F：5JAGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGT TACGACTT-3E，进行PCR扩增。PCR反应体系（25肛严：DNA模板4.0!L，上游下游引物各1!L，Taq PCR Master Mix12.5“L’ddN#。9.5皿PCR扩增程序：94!预变性2min；94!变性30s，54!退火30s，72!延伸1min，25个循环。
1.2.3.3鉴定取扩增的PCR产物5^L进行电泳（100V, 30min），并观察凝胶成像结果。PCR产物由奥美德诺（北京）基因科技有限公司测序，将所得序列通过NCBI-BLAST系统进行序列结果分析，并与基因库显示的标准菌株序列进行同源性比对，确定待检菌株的种类!10"并构建系统发育进化树。
1.2.4乳酸菌的抗逆性筛选
1.2.4.1耐酸试验挑取单菌落，37!活化培养8h，调整菌液浓度1x108cfu/mL，取1mL菌液，分别加入到
不同pH值的MRS液体培养基中。摇床培养3h后，进行倍比，取105、10~、10-7三个稀释梯度的菌液各100“L，均匀涂布于MRS固体培养基上，每个浓度做3个重复，对照组按上述方法做同样处理,37!培养48h后，进行菌落计数［11］。按照下述公式计算乳酸菌的存活率。
存活率=!/!c x100%，式中：和!分别为经人工模拟胃酸处理0和"小时后的活菌数（！#和！"均为对数值）。试验分组如表1o
表1耐酸试验分组
组pH值
I  2.0
3.0
4.0
对照  6.6 1.2.4.2耐胆盐试验挑取单菌落，37!活化培养8h，调整菌液浓度为1x108cfu/mL，取1mL菌液，分别加入到不同胆盐浓度的MRS液体培养基中。摇床培养3h后，进行倍比稀释，取10-5、1026、10-7三个稀释梯度的菌液各100“L，均匀涂布于MRS固体培养基上，每个浓度做3个重复，对
照组按上述方法做同样处理,37!培养48h 后，进行菌落计数。1.2.4.1式计算乳酸菌的存活率。试验分组如表2。
表2耐胆盐试验分组
组胆盐浓度/% I0.3
/0.6
00.9
对0.0
2结果与分析
2.1乳酸菌的分离纯化
经多次分离纯化以后，共获得11株有溶钙圈的菌株，分别命名为R1~R9、R11和R12，菌落及菌体形态见1（部分）和表3。
A.菌落形态
B.溶钙圈
C.R1镜检结果(40x100)
D.R12镜检结果(40x100)
图1菌落特征及镜检结果
表3菌株编号及培养形态观察
菌株编号菌落形态菌体形态革兰氏染结果R1菌落大而光滑，边缘整齐，白，圆形凸起球形阳性
R2菌落光滑整齐，白凸起球形阳性
R3菌落光滑整齐，白凸起球形阳性
R4菌落光滑整齐，白凸起球形阳性适合中学生看的书
R5菌落大而光滑，边缘整齐，白，圆形凸起球形阳性
R6菌落大而光滑，边缘整齐，白，圆形凸起球形阳性
R7菌落大而光滑，边缘整齐，白，圆形凸起球形阳性
R8菌落大而光滑，边缘整齐，白，圆形凸起球形阳性
R9菌落大而光滑，边缘整齐，白，圆形凸起球形阳性
R11菌落光滑凸起，灰白，不透明球形阳性
R12菌落光滑凸起，灰白，不透明短杆形阳性
2.2生化鉴定
生化试验结果如表4。
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行初步判定，结果表明，R1、R2为杜氏肠球菌;R3、R7为乳酸肠球菌;R4、R5、R6、R8、R9为屎肠球菌;R11为鼠李糖乳杆菌;R12为莱菲氏肠球菌。
2.316S/DNA鉴定
11株细菌的基因组DNA经过PCR技术扩增以后，再对其得到最终产物进行凝胶电泳试验。如图2所示，
在15007p处均出现了相当明显的特异性条带，与预期结果。
2.4同源性分析及系统发育进化树的构建
扩增产物由OmegaGenetics公司测序，测序结果采用NCBI-BLAST方法进行分析，得到其同源性分析结果，如表5
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。
表4 11株菌株生化试验结果
菌株 葡萄糖 棉子糖 山梨醇 乳糖 蔗糖 甘露醇 棉子糖 L_阿伯糖 水杨6 松三糖 木糖
接触酶反应
R1 + + ++ ++ + + + +— -
注:“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应
R2
++++++++++ - -
R3++++++++R4++++++++R5
++++++++R6++++++++R7++++++++R8
++++++++R9+++
+++++R11
+++++++-+R12
+
+
+
+
+
+
+
-
+
图2 16SrDNAPCR 扩增结果
M  R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7M  R8 R9 R11 R12
2000 bp -------
-------1500 bp  —
1000 bp --------750 bp ——
500 bp --------250 bp --------
100 bp --------
表5分离菌株的序列比对结果
菌株
菌株
性/%R1肠 菌(AB795648.1)99.23
R2
杜氏肠球菌(MH891688.1)
99.30R3乳酸肠球菌(FJ015055.1)99.13
R4
屎肠球菌(JQ067694.1)99.25R5屎肠球菌(JN542513.1)97.84
R6
屎肠球菌(JN542513.1)99.01
R7乳酸肠球菌(KM497525.1)
99.46R8屎肠球菌(JN542513.1)97.21R9屎肠球菌(JN542513.1)
98.63
R11
鼠李糖乳杆(MH773159.1)
98.94R12
肠 NR026499.1
99.34
R8
R9
R6
R5
乳酸肠球菌(FJ015055.1)屎肠球菌(JQ067694.1)屎肠球菌(J  N 542513.1)
乳酸肠球菌(KM497525.1)R4
R3
R7
杜氏肠球菌(AB795648.1)
肠球菌(MH891688.1)
’R1
6^ R2
——R12
隐藏文件夹
闻官军收河南河北的意思
97，(莱菲氏肠球菌爪R  026499.1
(鼠李糖乳杆菌)MH773159.1
10" R11
84
从GenBank 中筛选相关模式菌株16S  rDNA 序列，将
测序序列与标准菌株序列用MEGA  5.10软件Clustal  W
方法进行多序列比对，并构建系统发育进化树。系统发
育树如图3所示。
2.5菌株耐酸试验结果
大多数哺乳动物正常的肠胃pH 值在3.5左右，胃
肠道菌在 中 正常的 动，但0.05
图3系统发育进化树构建结果
些病理原因，肠道pH 值发生变化，一些菌活性降低甚
至死亡，肠道菌发 改变， 肠道疾病。
由图4可知,11株乳酸菌在不同pH 值的MRS 培养
基中
的。 的 ，11株乳酸菌的
， 在 pH  值 2 ，11 株 菌的
率在48.13%~86.24%之间，表明所分离的11株益生菌 有较强的耐酸特性，其中R3、R4、R7、R8、R11菌株的存 活率超过70%，有很强的酸性耐受力。
o  o  o  o  o  o  O
6 5 4 3 2 1 总/>陵忡
2.6菌株耐胆盐试验结果
因为多数哺乳动物肠道如人类和猪的胆盐浓度根 据不同部位而有所不同，但大多数都在0.03%~0.30%区 间，肠道胆盐浓度增加，也会造成肠道菌失衡，而乳酸
菌要定植在小肠内，必须能耐受一定浓度的胆汁。
图5显示，11株益生菌在不同胆盐浓度MRS 培养 基中的生长情况不同。随着胆盐浓度的增加，11株益生
菌的存活率逐渐降低，在0.6%浓度胆盐下，除R11、R12
外，其余各株益生菌的存活率均保持在25%以上；在 0.9%浓度胆盐下，R3、R4、R7、R8菌株存活率仍在20%
以上，对胆盐耐受力较强。5 0 5 0­
2 2 1 10.30%■ 0.60%■ 0.90%
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 Rll  R12
图5 11株乳酸菌在不同胆盐浓度MRS 培养基中的存活率
3讨论
在现代养殖模式下，山羊养殖更多采用粗精饲料结
合的饲养方式，但 过多会产生一系列代谢病。
所以，现在 动物养 + 酸的
饲养方式，青贮饲料完全符合这一标准，但青贮饲料里
的
性差，难以分解消化。乳酸菌能够促进青
贮饲料中碳水化合物、脂肪、蛋白质的分解，产生便于吸 收的小分子物质，也可以分解少量纤维素，增加适口性。
另外，乳酸菌能
肠道菌，合成一部分维生素。但
乳酸菌的生
和代 物的不同，不能很
在肠道定植和 ， 不 同益生菌
肠道
，能 定植 生
长繁殖，因此同源乳酸菌筛选和培 究是必然发展
方向［12］o
乳酸菌若要到达肠道定植并发挥作用，必须能够耐 受机体的防御机制。其中胃酸的杀伤力最强，其次是胆
汁酸，所以在体外能够耐受较大浓度的酸和胆盐是筛选
乳酸菌的主要技术指标。能够通过低pH 值胃液(p4=2~
4)和高胆盐(0.3%~0.9%)并存活下来问，这要求乳酸菌 具有较强的耐受胃酸和胆汁的能力。所以，获得耐酸和
耐胆盐能力强的菌种是开发其益生菌株的首要前提。
本次试验共筛选出11株菌，其中10株球菌，1株杆 菌。田益等［14］究发现，羊瘤中的主要优势菌种为
拟杆菌门和厚壁菌门，与本试验结果一致。瘤胃球菌属
属于厚壁菌门，是瘤 的主要降解菌，因为散养
山羊自由采食绿植物，纤维摄入较多，与理论相符。经 过抗逆试验筛选出的菌株R3、R7、R8、R11在pH=2时存 活率超过70%；R4、R11存活率超过80%，具有较强的耐
酸能力。在0.9%浓度胆盐下,R3、R4、R7、R8菌株的存活
率仍在20%以上;R4存活率超过30%，具有较强的胆盐 耐受力。R11为鼠李糖乳杆菌(MH773159.1)，耐酸性较
强，但胆盐耐受力较差，与王玉华等［15W 究 不符，推
测鼠李糖乳杆菌的来 不同导致。
综上所述,R4(屎肠球菌JQ067694.1)菌株耐酸和胆
盐的耐受力最强，具有较好的生产应用潜力。但其生长
曲线酸曲线、抑菌 以及对机体的安全性和临床 应用价值，需进一步研究。
参考文献
拍一拍功能添加字［1］ 袁启志，陶新，邓波，等.低蛋白氨基酸平衡日粮在生长育肥猪上
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