病毒一般是指由核酸和蛋白质外壳组成的具有侵染活性的细胞内寄生生...
病毒的结构与研究技术
柳正(0313302152)
中山大学生命科学学院
摘要：文章简要介绍了病毒常见的三维结构，并且介绍了研究病毒三维结构的方法,X射线单晶衍射分析技术，电子显微学技术，核磁共振技术.
关键词：正二十面体；螺旋对称;X射线衍射；核磁共振；冷冻电镜三维重构.
病毒一般是指由核酸和蛋白质外壳组成的具有侵染活性的细胞内寄生生物.迄今为止是人们在超微世界里所认识的最小生物之一[1].自从人们发现病毒以后，对病毒形态与结构研究一直是病毒学家孜孜探索的课题，病毒的形态结构是自然选择的结果，是功能的体现者.其生理状态结构的真实阐明是对其生存机制和侵染功能了解的有效途径，自1935年美国科学家Stanly获得烟草花叶病毒(TMV)的结晶,1939年德国科学家Kausch 利用电子显微镜看到TMV 长形粒子以来, 原有研究病毒的结构技术不断更新，新技术不断涌现.[2]2013笑傲江湖演员表
1病毒的形态结构
病毒的形态是多种多样的，在电子显微镜下不同的病毒有不同的形态，同一种病毒也不尽相同.最初应用电镜技术观察病毒形态只有球形，杆状，蝌蚪形.随着研究技术发展，对病毒的形态结构越来越精细，球状，弹状，砖形，冠状，杯状，轮状，肾形，等多种多样的形状，从这些千差万别的形态中，病毒取型只有两种基本的形状，一是多面体型，另外一种是螺旋型.根据病毒本身形态结构特点，和衣壳对称型划分为四种,.二十面体对称病毒，螺旋对称病毒，复合对称病毒，复杂对称病毒.[3]
其它相关形态空瘪型病毒颗粒，在对称壳膜病毒感染的细胞中，往往见到中空的或者空瘪形的病毒颗粒，是由于其中核酸没有或者含量较少，有学者认为存在这种可能是病毒样品处理过程中，病毒遭到破坏，核酸丢失造成，另一种可能壳膜装配时核酸还没有装入进去的暂时形态.病毒的衣膜在其壳膜外表面有一层含有磷脂的衣膜，其来源包括有宿主细胞的质膜或者宿主细胞的核膜如疱疹病毒在核内装配核壳，当它经过核膜时带上一层外膜，当从细胞质卷出胞外时又带有另外一层细胞膜.把这类带有来自宿主细胞的膜性结构称为披膜病毒.[4]
1.1正二十面体病毒结构
在立体对称中，除了一些噬菌体具有八面体对称外,Crick和Watson断定有些球形病毒时二十面体对称的.现已已经证实许多动物病毒都具有二十面体对称.
一般说来，正二十面体衣壳分两级形态结构：一是由蛋白质原体的短带形成电镜可见的壳粒结构，二
是由壳粒进一步排列形成的衣壳.原体和壳粒都是通过非共价键结合在一起，原体间键比壳粒间键要短.这造成在电镜下能够看到区分壳粒，而不能区分原体.衣壳呈二十面体对称，主要由它的蛋白质一级结构决定，是原体和壳粒遵循几何晶体集结形成的.空心衣壳在提纯时往往可以解离成完整的壳粒，在用化学试剂裂解病毒时，可以得到原体和一些寡聚体. 二十面体是由20个等边三角形的面,20个顶点和30条棱所组成.若以相对应的顶点为轴旋转72度其型不变，旋转5次复位，称为5-重对称轴；若以相对应的三角形面的中心连线为轴，旋转120度其型不变，旋转3次复位，称为3-重对称；若以相对应的棱的中点连线为轴，旋转180度其型不变，旋转2次复位，称为2-重对称轴.对于病毒是二十面体的证实，一是利用X射线技术获得脊髓灰质炎病毒结晶样品的清晰的衍射图象，二是电镜技术，用双屏蔽方法测定的大纹红
病毒立体构型.另外高分辨电镜的问世和复染技术完善，已能把正二十面体病毒细微结构奇迹般的显露出来.[5]
1.2螺旋对称病毒结构[3]
黄山风景区螺旋对称病毒结构是由核酸分子和蛋白质分子以非共价键形式结合形成螺旋状或柱状核衣壳而成，往往核酸绕主轴缠绕形成螺旋骨架.蛋白质在核酸外面，以保护核酸不受外界条件的作用，构成了病毒的二级螺旋，一级螺旋是核酸分子本身.二级螺旋多呈线形(或杆状)，在植物病毒中裸体的病毒粒子.在动
物病毒中，这种结构继续盘旋形成所谓三级螺旋，位于球形，弹状病毒之中，构成了病毒的生命中心.螺旋对称病毒的外部形态是多样性的，它可以呈杆状也可以呈球形.但核衣壳形状却是同一的，多数呈柱状螺旋或管状螺旋.即使球形病毒，内部盘卷着的核衣壳展开后，仍然是螺旋状形态核结构.
螺旋对称病毒核衣壳结构的主要形态亚单位称为原体(亚基).它们都是以等价原理构成.在动植物病毒中，大约有近半数的病毒属于此类结构，都为单链(--)RNA病毒.衣壳是由原体沿着螺旋状核酸链有规律地排列起来的圆柱体而构成.相同的原体，以共价键的形式头尾相接，构成一带状结构：一种情况是这种带状结构绕着圆柱体中心线—旋转对称轴，按一定角度缠绕形成螺旋，这样两条带之间的原体彼此又以侧键连接，并且所有原体的侧键连接方式也都相同的，由于两条带上的原体彼此不是在同一直线上排列，是叉开的，所以一个原体与邻近的另外一条带上的两个原体，连接成键，这一模型在结构上提供了很大的稳定性，而且原体的排列相当紧密，以保护内部核酸不受外界的作用；另外一种情况，虽然也构成螺旋，但是两条是非连续的，其螺旋是由多层圆盘堆落而成的，每层圆盘的原体也是同邻近圆盘的两个原体连接成键，保持构型不变.螺旋对称衣壳直径，是由原体特性决定的，而衣壳的长度则是由于包装的核酸长度决定的.螺旋对称病毒衣壳的结构特征，数学模型为核酸绕主轴旋转而成的圆柱螺旋线，它符合螺旋参数方程所具有的特性.
1.3其它两种病毒的结构
星际之狼
酋长的男人
复合对称的病毒结构实际是立体对称和螺旋对称的叠加，如典型的噬菌体. 在电子显微镜下有三种形态：即蝌蚪形、微球形和丝杆形。大多数噬菌体呈蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。头部含噬菌体的遗传物质核酸；尾部是一管状器官，由一个中空的尾髓和外面包绕的尾鞘组成。尾髓具有收缩功能，使头部核酸注入宿主菌体内。头部与尾部连接处有一尾领结构，可能与头部装配有关.核酸包在头部外壳中，头是二十面体对称，而尾是螺旋对称.
复杂对称型病毒主要是指痘病毒科成员，它的结构复杂，形态呈砖形，对称性比较复杂，研究较为困难.
2病毒结构研究技术
病毒及其亚单位蛋白的三维结构(3D)解析是认识病毒蛋白功能的有力手段。对病毒结构的认识正经历着病毒粒子电镜结构、纳米水平的精细结构及病毒组成蛋白原子水平3D结构的变化。在原子水平上认识病毒蛋白的结构，这为从结构生物学的角度认识病毒复制、病毒粒子的装配、病毒的致病与免疫机理及抗病毒药物设计提供了技术平台.
常用来测定病毒的三维结构的技术是X射线单晶衍射分析技术，电子显微学技术，核磁共振技术.
2.1 X射线单晶衍射技术.
清明谚语
X射线单晶衍射技术是1912年德国科学家W.H.Bragg和L.Bragg父子建立的，自1953
年,James D.Watson和Francis H.C.Crick利用DNA晶体数据进行分析，并且得到划时代的结果后，，逐渐成为研究生物大分子的重要手段.X射线衍射法测定晶体结构的理论依据，在于晶体结构同它的衍射效应之间互为傅立叶变换.衍射效应是指从晶体各个方向发出的衍射波的振幅和相位.从衍射波的振幅和相位，利用数学上的傅立叶变换，可以算出晶胞的电子密度图，在电子密度图重面具有高电子密度的峰就代表结构中的原子.从振幅到相位的转换，是测定晶体结构的关键.现已发展起来的有1.重原子法，即当晶体中含有某种金属原子或者其它原子虚数较大的原子时，由于与所有其它原子相比，重原子对衍射的贡献起决定作用，再根据重原子再晶胞中的位置，并可推算出相位，用所得到的相位来代替由全体原子贡献的相位，这样得到的相位粗略的近似正确的相位.2同晶置换法，指用置换法制备出代测衍生物，通常是重原子的衍生物，而且衍生物的晶体和母体晶体是同晶型.的，如果知道了重原子的位置，就可以根据母体和衍生物两者在衍射强度上的差异推算出相应的衍射相位.现已帕特森函数为基础的重原子法和同晶置换法分别发展成为解决生物大分子晶体结构相位问题的主要方法.[6] X-射线衍射技术解析病毒结构最重要的方法是对纯化病毒形成的晶体进行X-射线衍射分析，从而可在原子水平上认识病毒的结构。但一些因素影响了X射线衍射图谱技术对病毒的分析:1病毒必须高度纯化且保持结构整体性，以形成足够大的结晶，经X射线衍射后才能形成显著的衍射图，否则影响特异衍射信息的收集;2部分病毒仅仅能得到微晶，这些晶体用X射线衍射技术不能得到足够的分析信息，必须使用更
强的同步辐射技术产生更强的光束，以进行进一步的分析;3不规则的有囊膜病毒不容易形成晶体，从而难以得到完整的原子结构解析.迄今同步辐射X射线源测得的较大结构是篮舌病毒(bluetongue virus)，直径69nm，分辨率0.35nm.[7]
2.2核磁共振技术
早在1945年，物理学家Felix Bloch 和Edward Purcell就发现把有些原子核放在强磁场下，由于所谓核自旋的作用，它们能够吸收特定波长的电磁波，即发生共振。随后，人们发现核共振的频率不仅依赖于磁场的强度和原子类别，还依赖于原子所处的环境。而且，不同核的核自旋能够相互影响，从而产生精细结构，即在核磁共振谱图中产生更多的谱峰。在上个世纪80年代初，Kurt Wüthrich发展了一套怎样将核磁共振方法延伸到生物大分子领域的思路。他发明了一套系统方法，将每一个核磁共振信号与大分子中的氢核（质子）一一对应起来。这种方法叫做“序列指认”，目前已经成为所有核磁共振结构研究的基石。他还指出了怎样能够在大量质子中确定每一对质子间的距离。利用这些信息，通过基于距离几何的一种数学方法，就能够计算分子的三维结构.[6]
在许多方面，核磁共振都能对X-射线晶体学结构测定进行补充。如果对同一种蛋白质用两种方法进行研究，一种在溶液状态，一种在结晶状态，通常可以得到相同的结果，只是在一些受环境影响的表面区域二者有不同。这些区域在晶体中受到紧密堆积的临近蛋白质分子的影响，而在溶液中则受到周围
溶剂分子的影响。X-射线晶体学的能力体现在能够精确测定相当大的分子的三维结构，而核磁共振则有另外一些独特的优势。在溶液中进行研究就意味着可以模拟生理条件。核磁共振的一项特殊能力就是可以研究分子中无结构的和非常活动的部分，因而可以阐明分子的运动性，动力学以及这些特性在蛋白质链中各部分的差异。对蛋白质进行稳定同位素标记也有助于确定分子结构。用核磁共振确定的蛋白质结构的一个例子就是与一系列危险疾病（如疯牛病）的发展相关的朊病毒蛋白. [8]
这种技术仅限于分子量不大于3～4万小分子的分析，而且所得到的信息不能被现有的其它分析技术解译。在病毒学上主要用于病毒短肽分子与抗体小肽表位间空间构象变化的研究。
2.3电子显微学的方法[5,7]山东限电
电子显微学方法，电子晶体学是其中之一，常用于蛋白质晶体结构研究，故也称为蛋白质电子晶体学.与Ｘ射线晶体学相似，它主要借助电子与晶体的相互作用来研究晶体结构.但由于固体对电子的散射远大于固体对Ｘ射线的散射，电子与固体相互作用也较Ｘ射线相互作用复杂得多，电子可以会聚成像等特点，这使电子晶体学又与Ｘ射线晶体学有所不同.首先，电子晶体学只需样品是几微米大小，约20ｎｍ厚的一层单胞的片晶(二维晶体)，制备较简单.尤其是自身具有部分亲水、部分疏水结构的膜蛋白，相对较易生成二维片晶.其次，电子晶体学不仅能从电子衍射谱中获得电子衍射数据，而且还能够从电子显微镜像中获得晶体结构信息.实际上，电子晶体学方法是从电子衍射谱中获得结构函数的振幅，从
成像中获得结构函数的相位，因此数据处理较Ｘ射线晶体学简单，但分辨率相对较低，目前最高的接近0.3nm.
另一种方法称为冷冻电镜计算机三维重构方法或单颗粒技术.这种技术特点是：急速冷冻(103-4℃/s)样品悬液，样品被包埋在无定形的非晶态冰薄膜中，这样既不损伤样品，又可使样品保持着自然状态，因而样品制备简单，缺点是分辨率稍低.利用这种技术研究的病毒样品，目前分辨率接近0.7nm.
冷冻电镜计算机三维重构方法20世纪70年代初，人们通过电子显微镜，应用相位衬度成像，可直接获得原子像.然而生物材料却困难得多.第一个困难是电子辐射损伤.我们可以采取低剂量技术，使用小于0.5Ev/A0.2的电子束，生物材料就不会被损伤，此时统计噪音远大于信号，信号被遮盖了，但用叠加或平均的方法就能很好解决.
另一个困难是生物材料在自然状态下都含有水分，当进入电镜的高真空时会发生强烈的脱水(干燥)，使三维结构发生严重的畸变.解决办法可采用冷冻水合技术.生物材料在含水的自然状态下，迅速浸入被液氮冷却的乙烷中，使样品能高速冷冻(103—104℃/s)，水来不及结成冰晶而形成玻璃态的冰，非晶的冰不会损伤样品.病毒悬液滴于有许多微米级的孔的所谓微筛膜(作支持)上，在这些小孔中就形成厚约20nm的薄冰，包埋和保护着病毒.低温下(-160℃—-170℃)观察时，由于有薄冰的保护，病毒不但不会被干燥，而且能被瞬时冷冻固定下来，保持着完全的自然状态.这是冻冷电镜突出的优点.此外，
样品被冷冻后，生物材料提高了对电子辐射的抗性，一般冷冻水合的生物材料能承受的电子剂量比常温下增加一个数量级，部分解决了辐射损伤的问题.冷冻水合的生物大分子主要由Ｃ,Ｈ,Ｏ,Ｎ等轻元素组成，本身对电子散射差别很小，与冰之间也非常小，加上为防止辐射损伤，使用低剂量成像，结果像的信噪比非常差.因此，必须平均成千个分子像来提高信噪比.
一张电镜照片内含有许多病毒颗粒，但不能直接叠加，因为它们的取向不同；此外，电镜的像实际上是样品三维结构的二维投影，如何从二维投影中获得三维结构?三维重构是建立在中央截面定律基础上的.经过简单的数学推导就可以证实中央截面定律：三维物体的沿ｚ轴的二维投影ρ(ｘ,ｙ)的二维傅里叶变换Ｓ(ρｘ,ρｙ)与该物体的三维傅里叶变换Ｆ(ρｘ,ρｙ,ρｚ)在ｚ方向ｚ=0的中心截面Ｆ(ρｘ,ρｙ,0)等价，这就是中央截面定理.有了这个定理，可通过傅里叶变换把三维结构与二维投影之间的关系建立起来.当有各方向的足够多的二维投影就可获得这物体三维傅里叶变换各方向的足够多的中央截面，就可合成这物体的三维傅里叶变换，通过反变换就获得该物体的密度函数———三维结构.这种方法可以在很广的范围内应用，从无固定结构特征的细胞器和超分子复合体到大分子的晶体.详细的冷冻电镜与计算机三维重构方法可以参考文献[9].
由于应用冷冻电镜与计算机重构技术研究病毒三维结构所需样品制备简单，对病毒的大小没有限制，使其发展很快，至今已有100多个病毒的三维结构被冷冻电镜计算机重构方法所阐明，远远超过Ｘ射线晶体学的30—40种病毒的数量.而且有超过一半的病毒其直径大于Ｘ射线晶体学所测定三维结构中最
大的蓝舌病毒(69nm)，其中较大的有人疱疹病毒(125nm)、人巨细胞病毒(130nm)、双链ＤＮＡ小球藻病毒(190nm)和虹彩病毒(190nm).
3意义与展望
对病毒颗粒与衣壳蛋白的三维结构的了解，可以进一步的研究病毒蛋白酶的作用与病毒的致病机理.病毒如何识别细胞受体，病毒蛋白如何与细胞膜融合，都可以从其结构中获得有益的启发.通过研究病毒复制起始蛋白，转录酶等与病毒基因间空间关系，病毒蛋白与单域抗体间的空间关系，模拟其分子空间结构，设计可阻滞它们相互作用的药物分子，来设计抗病毒药物.
利用各种方法研究病毒或者及其蛋白的三维结构，是一种综合技术，包括病毒的提纯，培养，结晶，样品的制备的前期准备工作.还包括后期的数据提取，信息的采集，计算机算法的设计等等.随着多学科的交叉，多种技术的综合应用，如快速X衍射检测技术，计算机图谱分析，同步辐射加速器，原子力显微镜等高技术逐步应用于结构生物学的研究，必将使得病毒结构生物学的研究开拓新的天地.
参考文献:
1.黄祯祥.医学病毒学基础及试验技术.科学出版社,1990.2
2.洪健，李德葆，周雪平.植物病毒学分类图谱.科学出版社,2001.12
3.王继科，曲连东.病毒形态结构与结构参数.中国农业出版社,2000.5
4.殷震，刘景华.动物病毒学.科学出版社,1997.11
5.谌东华.二十面体单颗粒结构的电子显微学研究.博士学位论文，北京科技大学,2004.4
6.夏宗芗生命的化学基础.诺贝尔奖百年鉴.上海科技教育出版社2001.12
7.张景强，卢炘英，张勤奋.结构生物学的新进展.物理,2001,30(7):407-412
8.黄金海，杨汉春.蛋白结晶技术在病毒学中德应用.动物医学进展,2003,24(5)1-3
9.P.A.Thuman-Commike,W.Chiu.Reconstuction principles of icosahedral virus structure determination using electron cryomicroscopy Micro.2000,31:687-711
Structures of Virus and the Research Tecnology
Liu Zheng(0313302152)
The college of life science of SunYatsen University
Abstract :In this paper, the common three dimensional structures of virus were interpreted . The methods of studying the structure of virus were also introduced ,including X-ray diffraction technique ,Cro-Microscopy Nuclear magnetic resonancial technique.
Keywords : icosahedral structure ;helix-symmetry;X-ray diffraction technique ;Cro-Microscopy and 3D-reconstruction; Nuclear magnetic resonance.

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