小麦叶绿素酶基因家族的鉴定及其叶绿素降解过程中的功能预测
激光生物学报
ACTA　LASER　BIOLOGY　SINICA
Vol. 31 No. 1Feb. 2022
第31卷第1期2022年2月
收稿日期：2021-10-28；修回日期：2021-12-22。基金项目：山西省研究生创新项目（2020SY 212）；山西农业大学省部共建有机旱作农业国家重点实验室自主研发项目
（202002-2）；国家自然科学基金项目（31671607）。
作者简介：晋秀娟，硕士研究生。 * 通信作者：孙黛珍，教授，主要从事小麦遗传育种研究。E-mail: sdz 64@126 。
小麦叶绿素酶基因家族的鉴定及其叶绿素降解过程
中的功能预测
晋秀娟1，2，孙丽丽1，2，赵　锴1，2，ISLAM Md Ashraful 1，2，卢　娟1，2，王曙光1，2，孙黛珍
1，
2*
（1. 山西农业大学农学院，太谷 030 01；2. 省部共建有机旱作农业国家重点实验室（筹），太原 030031）
摘　要：
叶绿素酶（CLH ）是植物叶绿素降解过程中的关键酶，在植物生长发育过程中发挥着重要作用。为了解小麦CLH 基因家族成员在叶绿素降解过程中的功能差异，本试验采用生物信息学分析方法和实时荧光定量PCR （qRT-PCR ）技术对小麦CLH 基因家族进行鉴定和初步功能分析，结果表明：小麦中共鉴定到13个CLH 成员（TaCLH1～TaCLH13），分布在3A 、3B 、3D 、4B 、5A 、5D 、6A 、6B 和6D 染体上；其中13个家族成员的启动子中均含有植物激素响应元件、环境胁迫响应元件和植物生长发育响应元件；分析TaCLHs 在不同组织和不同发育阶段中的表达模式发现，大部分成员在叶/嫩枝和穗中有表达；结合qRT-PCR 分析发现，TaCLHs 在不同的生长发育阶段参与叶绿素降解过程。这些研究结果都为后续研究相关基因的功能奠定了基础。关键词：
小麦；CLH 基因家族；叶绿素降解；表达分析；qRT-PCR 中图分类号：
S 512.1；Q 78                    文献标志码：A DOI ：
10.3969/j.issn.1007-7146.2022.01.008Identification of CLH  Gene Family and Functional Prediction of
Chlorophyll Degradation in Wheat
JIN Xiujuan 1, 2, SUN Lili 1, 2, ZHAO Kai 1, 2, ISLAM Md Ashraful 1, 2, LU Juan 1, 2, WANG Shuguang 1, 2,
SUN Daizhen 1, 2*
(1. College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2. The Provincial and Ministerial Joint
Construction of the State Key Laboratory of Organic Dry Farming (in preparation), Taiyuan 030031, China)
Abstract: Chlorophyllase is the key enzyme in plant chlorophyll degradation process and plays an important role in plant
growth and development. To understand the functional differences of CLH  gene family members in wheat during chlorophyll degradation, the bioinformatics analysis method and real-time fluorescence quantitative (qRT-PCR) technology were used to identify and analyze the CLH  gene family in wheat. The results showed that 13 TaCLHs (TaCLH1 ～ TaCLH13) were identi-fied in wheat genome and distributed on chromosomes 3A, 3B, 3D, 4B, 5A, 5D, 6A, 6B and 6D. The promoter regions of Ta-CLHs  contained plant hormone response elements, environmental stress response elements and plant growth response elements. Analysis of TaCLHs  expression patterns in different tissues and different developmental stages showed that most of the mem-bers expressed in leaves/shoots and panicles. In addition, qRT-PCR analysis showed that TaCLHs  were involved in chlorophyll degradation at different growth stages, which laid the foundation for further study of CLH  gene function in wheat.
Key words: wheat; CLH  gene family; chlorophyll degradation; expression analysis; qRT-PCR  （Acta  Laser  Biology  Sinica , 2022, 31(1): 050-060）
1第1期
叶绿素（chlorophyll，Chl）是植物进行光合作用的重要素，其合成与降解在植株整个生育期内是一
个动态过程。据报道，全球每年约有1012 kg叶绿素在植物体内被降解［1］，其中水分亏缺［2］、温度降低［3］、病虫害侵袭［4］等都会加速叶绿素降解。叶绿素降解是一个多种酶共同参与调节的代谢过程，主要包括叶绿素酶（chlorophyllase，CLH）、脱镁叶绿素酶（pheophytin pheophorbide hydrolyase，PPH）、脱镁螯合酶（stay-green，SGR）、脱镁叶绿酸a氧化酶（phe-ide a oxidase，PAO）和叶绿素红降解物还原酶（red chlorophyll catabolite reductase，RCCR）等［5-6］。其中CLH是叶绿素降解过程中的关键限速酶，能将叶绿素水解成羧酸的脱植基叶绿素和植醇［7］。
不同植物的CLH在生长发育过程中扮演的角有明显差异。研究发现，菜豆（Phaseolus vulgar-is）中的CLH活性在新鲜叶片中最高，而在衰老的过程中其活性不断下降［8］。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中发现2个AtCLHs在幼叶中的基因表达和酶活均远远高于成熟和衰老期的叶片［9］，且敲除这2个AtCLHs后并不会影响衰老过程中叶绿素的正常降解［10］，表明CLH主要在生长发育前期起作用。然而也有大量的研究表明，CLH参与了衰老过程中的叶绿素降解。例如：在娄叶（Piper betle）衰老的过程中，叶片叶绿素含量降低，CLH活性升高，说明娄叶的CLH参与了叶绿素降解［11］；在青花菜（Brassica oleracea）采后衰老的过程中，叶绿素降解速率增快的同时BoCLH2表达量快速升高，叶绿素降解速率减慢的同时BoCLH2的表达量也会变低，表明BoCLH2在储藏过程中的叶绿素降解途径中起重要作用［12］；张兰等［13］分析了不同时期草地早熟禾（Poa pratensis）叶片中CLH基因的表达，发现衰老叶中PpCLH1的表达量是幼嫩叶片的27.80倍，表明CLH在衰老过程
中发挥了关键作用。此外，前人在柑橘（Citrus reticulata Blanco）［5］、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）［14］、银杏（Ginkgo bi-loba）［15］和藜（Chenopodium album）［16］等植物中相继分离到CLH基因，并对其进行了初步研究，发现不同物种的CLH基因在植物生长发育过程中具有不同的表达模式和功能。
小麦（Triticum aestivum）是世界上分布最为广泛的禾本科作物之一，其高产稳产对于国家的粮食安全具有重要意义。小麦高产稳产的实现需要从源头抓起，即提高光合作用能力，确保“源”大、“流”畅、“库”足。叶绿素是小麦进行光合作用的主要素，叶绿素降解的加快会使叶片发黄、灌浆时间缩短、籽粒不饱满，最终导致小麦减产［17］。迄今为止，小麦CLH基因家族成员尚未被鉴定，而且CLH家族成员如何在小麦的叶绿素降解过程中发挥作用有待进一步研究。
鉴于此，本研究利用生物信息学分析方法明确小麦CLH基因家族成员，并对其进行染体定位、理化性质、保守基序（motif）、基因结构、蛋白质二级结构以及启动子顺式作用元件分析，然后根据CLH 基因家族成员在不同组织和不同胁迫处理下的表达模式，初步鉴定TaCLHs在叶绿素降解过程中发挥的作用，为后续基因功能鉴定奠定试验基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料
1.1.1　自然衰老材料
试验所用的花后自然衰老的冬小麦品种为烟农19，于2019年种植在山西农业大学农作站基地（北纬37°25′，东经112°25′），次年记录开花期。随机选取长势一致的植株，分别取花后0、7、10、16、
19、22、25和30 d的小麦植株旗叶用于时空表达模式分析。
1.1.2　胁迫处理材料
经次氯酸钠（2.6%）消毒的小麦种子在蒸馏水中浸泡12 h至露白后放置在光照培养箱内水培，待小麦幼苗长至两叶一心期进行非生物胁迫处理。
黑暗胁迫：分别置于光强为0 Lux的光照培养箱中处理0、6、12、24、48和72 h。
激素胁迫：分别置于添加了50μmol/L脱落酸（abscisic acid，ABA）、50μmol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）的溶液中处理0、6、12、24、48和72 h。
取各个时间点的小麦叶片迅速保存于–80℃冰箱，用于后续表达验证试验。
1.2　试验方法
试验所需小麦全基因组序列、蛋白序列和GTF 文件等均从Ensembl Plants数据库（/info/data/ftp/index.html）中下载。
1.2.1　小麦CLH基因家族成员的鉴定
从Pfam数据库（/）中下载
晋秀娟等：小麦叶绿素酶基因家族的鉴定及其叶绿素降解过程中的功能预测
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2第 31 卷
CLH基因家族的隐马尔可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）文件（PF07224），利用TBtools软件［18］的Simple HMM Seach功能检索小麦蛋白序列，将获得的蛋白作为CLH基因家族的候选成员。然后，将候选成员上传至Pfam数据库进行二次筛选，剔除掉不含有CLH结构域的蛋白序列，剩余蛋白即为小麦CLH基因家族的成员。
1.2.2　小麦CLH基因家族的系统进化分析
从Ensembl Plants数据库中下载小麦、藜麦、谷子、玉米和拟南芥的蛋白质序列，使用同1.2.1的方法确定各作物CLH基因家族成员。利用MEGA-X 软件中的邻接法（neighbor-joining， NJ）对这五个物种的CLH家族基因的蛋白序列构建系统发育树。
1.2.3　生物信息学分析
使用MEME网站（/meme/ index.html）对CLH基因家族的保守motif进行分析。从小麦基因信息GTF文件中提取TaCLHs的基因结构信息，并通过TBtools将motif和基因结构进行可视化。利用Expasy网站（pasy. org/protparam/）分析TaCLHs的分子量、等电点、稳定指数和疏水性等相关理化性质。利用cropPAL网站（/）对家族成员进行亚细胞定位预测。利用SOPMA网站（npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）预测CLH 家族成员的二级结构。通过TBtools软件从小麦全基因组序列中快速提取小麦CLH基因家族成员启动子区域（上游2 kb）。利用PlantCARE网站（ bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析与生物和非生物胁迫相关的顺式作用元件。1.2.4　小麦CLH基因家族的表达模式分析
为研究CLH家族成员在不同组织器官中的表达情况，将TaCLHs序列提交到ExpVIP数据库（www.wheat-expression/）中进行组织特异性分析，主要对4个组织（根、叶/嫩枝、穗和种子）的3个时期（幼苗期、营养生长期和生殖生长期）进行了分析。
1.2.5　植物总RNA提取与引物设计
利用Trizol法提取RNA。使用TaKaRa公司的反转录试剂盒合成cDNA第一条链。根据小麦数据库中公布的序列设计部分TaCLHs的荧光定量引物（表1），引物由北京擎科生物技术公司合成。1.2.6　实时荧光定量PCR与数据统计分析
使用TaKaRa公司的荧光定量试剂盒检测Ta-CLHs的表达模式。每个样本均设置3个平行样，内参基因Actin和TaCLHs均做3次生物学重复。采用
公务员年度考核个人总结2–△△Ct法计算基因的相对表达量。
2　结果与分析
2.1　TaCLHs的染体定位
通过小麦全基因组水平扫描共鉴定到13个TaCLHs，根据它们在染体上的分布位置将13个成员分别命名为TaCLH1～TaCLH13。13个家族成员主要分布在9条染体上（图1），分别是3A、3B、3D、4B、5A、5D、6A、6B和6D染体。其中在6B染体上分布着3个基因，分别是TaCLH10、Ta-CLH11和TaCLH12；在5D和6A染体上分别分布着2个基因，其余6条染体上均只有1个家族基因。
2.2　TaCLHs蛋白的系统进化分析
为了进一步研究CLH基因家族的系统发育关系，将小麦中的13个CLHs与藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）、谷子（Setaria italica）、拟南芥和玉米（Zea mays L.）中的CLH蛋白进行序列分析，构建系统发育树。结果表明（图2），五个物种的CLH基因家族成员共分为四大组（Group Ⅰ～Ⅳ），Group Ⅰ中只有藜麦和谷子的部分CLHs成员，而小麦的13个CLHs全部分布在其他三组中，其中Group Ⅱ中包含6个成员，Group Ⅲ中包含4个成员，Group Ⅳ中包含3个成员。通过对比分析发现，TaCLHs与单子叶植物玉米和谷子的亲缘关系较近，而与双子叶植物拟南芥和藜麦的亲缘关系较远。
2.3　TaCLHs的理化性质预测
分析13个TaCLHs的理化性质发现（表2）：Ta-CLHs编码的氨基酸个数介于290（TaCLH11）～329（TaCLH12）之间；相对分子量在30968.82（Ta-CLH11）～35668.10（TaCLH12）Da之间；理论等电点介于4.83（TaCLH4）～7.15（TaCLH3）之间，大部分属于弱酸性蛋白；总平均疏水指数均大于0，表明都是疏水性蛋白；除TaCLH4和TaCLH11的稳定指数大于40表现出不稳定外，其余11个成员的蛋白性质均稳定；此外，除了TaCLH12定位在质体内，其余12个TaCLHs均定位在细胞质基质中。
3第1期晋秀娟等：小麦叶绿素酶基因家族的鉴定及其叶绿素降解过程中的功能预测液晶电视的选择
表1　qRT-PCR引物序列
Tab. 1　qRT-PCR primer sequence
Primer name Primer sequence (5′-3′)Amplified product length/bp
Actin-F TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT
86
Actin-R ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT
TaCLH1-F CTAACTGCGGTGTCCATCTC
173
TaCLH1-R TTCGGCTTGTAGACCAGGATC
TaCLH2-F CGCAGCAGTCTCCTCCGA
154
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TaCLH2-R GCGATGACGATGAAGCCA
TaCLH3-F CCCCGCCAATCCTAGCCTA
213
TaCLH3-R CGTCGTCCATCATGTCAGTG
TaCLH5-F TGGTCAAGGACTACGGGCATCTC
94
TaCLH5-R TTGGTGTCGTGTTGGTTCCTCATG
TaCLH6-F GGTGGTGTCCGAGCCCGAT
217
TaCLH6-R CTTGGTCTTGGCGTCCCCT
TaCLH8-F GCTACATTGTGACCAAGGACTACGG
荿人图片139
TaCLH8-R AATGCCACCATGATCCCAGAAACG
周杰伦歌曲歌词
TaCLH13-F ACCACGCCGAGTTCTACCGC
169
TaCLH13-R ATGATCCCAGCAACGCACCT
表2　TaCLHs 的理化性质
Tab. 2　Physicochemical parameters of TaCLHs
Gene
name Gene ID Chro-
mosome Chromosome location
Amino
acid
number
Molecular
weight/Da pI
Stability
index
Average
coefficient
海南景点of hydro-
philicity
Prediction
of subcel-
lular local-
ization
TaCLH1TraesCS3A02G101900.13A66067781～6606915431132718.666.3534.850.124Cytosol TaCLH2TraesCS3B02G119400.13B89165912～8916735231232766.756.3534.590.181Cytosol TaCLH3TraesCS3D02G103900.13D56649175～5665056131132590.617.1534.470.179Cytosol TaCLH4TraesCS4B02G009600.14B6060805～606174931432835.424.8345.020.119Cytosol TaCLH5TraesCS5A02G355700.15A558245451～55824688232335402.145.9431.700.064Cytosol  TaCLH6TraesCS5D02G364100.15D441864736～44186627332435492.335.6132.470.101Cytosol TaCLH7TraesCS5D02G364200.15D441881870～44188303732335500.345.9931.200.074Cytosol TaCLH8TraesCS6A02G002900.16A1062071～106354731533943.366.5638.650.035Cytosol TaCLH9TraesCS6A02G146000.16A124311307～12431285931533440.756.2137.020.111Cytosol TaCLH10TraesCS6B02G008100.16B5101243～510262131533814.176.2135.970.086Cytosol TaCLH11TraesCS6B02G174300.16B188696006～18869742729030968.825.8142.630.094Cytosol TaCLH12TraesCS6B02G422500.16B692647766～69264989732935668.105.4335.970.021Plastid TaCLH13TraesCS6D02G135300.16D103035128～10303675231933876.095.7138.250.114Cytosol
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第 31 卷
2.4　TaCLHs 基因家族的保守基序和基因结构分析
为了进一步查小麦中CLH 家族成员所包含的保守序列，使用MEME 网站预测保守基序（mo-tifs ），结果发现（图3）：13个TaCLHs 中最多出现了21个motifs ，其中TaCLH 1、TaCLH 2和TaCLH 3均含有13个相同的motifs ；
TaCLH 8、TaCLH 9、TaCLH 10和TaCLH 13同样含有12个相同的motifs 。此外，13个TaCLHs 基因中均包含motif 8、1、6、3、4、2、9，
这7个motifs 出现频率最高，为100%；而motif 20和21均只在一个基因中出现，频率最低，为7.69%。
对比motif 序列发现，
motif 3中含有一个以丝氨酸残基为中心的“GHSRGG ”的脂肪酶保守区域。
分析TaCLHs 的基因结构，发现内含子和外显子数量差异较小，主要分为三大类，其中只含有一
个外显子的基因是TaCLH4，占总数的7.69%；含有两个外显子的基因有9个，占总数的69.23%；
含
Fig. 1　Chromosomal localization of TaCLHs
gene
图2　CLHs 蛋白的系统发育树
Fig. 2　Phylogenetic tree of CLHs proteins

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