玉米脱落酸受体ZmPYL9基因的克隆及功能探究
河南农业科学,2020,49(1):18-23Journal of Henan Agricultural Sciences
doi :10.15933/jki.1004-3268.2020.01.003
收稿日期:2019-05-15
基金项目：河南省重大科技专项(151100111100)
作者简介：王延召(1978-)，男，河南禹州人，副研究员，博士，主要从事玉米遗传育种研究㊂E -mail:yz9839@126 通信作者：黄㊀保(1980-)，男，辽宁辽阳人，助理研究员，硕士，主要从事科研管理㊂E -mail:huangbao910@126
玉米脱落酸受体ZmPYL9基因的克隆及功能探究
王延召，鲁晓民，魏良明，周㊀波，黄㊀保
(河南省农业科学院粮食作物研究所，河南郑州450002)
摘要：脱落酸(ABA )参与植物发育过程以及调控多种非生物胁迫的适应性,PYL 基因作为ABA 受体，直接影响ABA 的生物合成㊂为了探究玉米中PYL 家族基因的功能，克隆了一个ZmPYL9基因，该基因编
码197个氨基酸；物种同源蛋白质系统进化分析发现,ZmPYL9与高粱同源蛋白相似度甚高，且具有相同的保守基序；启动子顺式作用元件分析发现,ZmPYL9基因ATG 上游2000bp
区域含有多种激素应答相关的结合位点;ZmPYL9基因组织表达分析结果表明，该基因属于组成型表达，在胚乳中高度表达㊂ZmPYL9基因正向响应外源ABA 诱导，恢复正常培养后，该基因表达量急速下降且低于CK ；但是ZmPYL9基因受PEG 和PEG +ABA 负向诱导，且在PEG +ABA 胁迫下该基因表达量高于PEG 胁迫下，恢复正常培养后,2种胁迫下该基因的表达量均表现上升趋势㊂说明ZmPYL9基因响应干旱胁迫和ABA 诱导，且ABA 可以提高干旱胁迫下该基因的表达量㊂关键词：玉米；脱落酸受体；组成型表达；干旱胁迫;ABA 诱导
中图分类号:S513㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2020)01-0018-06用纸折盒子
Cloning and Function Analysis of Maize Abscisic
Acid Receptor ZmPYL9Gene
WANG Yanzhao,LU Xiaomin,WEI Liangming,ZHOU Bo,HUANG Bao
(Cereal Crop Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)
Abstract :Abscisic acid(ABA)participates in plant development and regulates the adaptability of various
abiotic stresses.The PYL gene acts as an ABA receptor and directly affects the biosynthesis of ABA.In or-der to explore the function of the PYL family gene in maize,a ZmPYL9gene was cloned,encoding 197amino acids.Evolutionary analysis of homologous proteins revealed that ZmPYL9was highly homologous to sorghum homologous proteins and had the same conserved motif.Analysis of the promoter cis-acting ele-ment revealed that the 2000bp upstream of the ATG of the ZmPYL9gene contained multiple hormone-responsive binding sites.The tissue expression analysis of ZmPYL9gene indicated that the gene was con-stitutively expressed and highly expressed in endosperm.The positive response of ZmPYL9gene was in-duced by exogenous ABA,and the expression of this gene decreased rapidly and was lower than CK level after returning to normal rehydration culture.The ZmPYL9gene was negatively induced by PEG and PEG +
ABA,and the gene expression was higher than PEG stress under PEG +ABA stress.However,after normal
rehydration,the expression of this gene under both stresses showed an upward trend.These indicate that
咖啡怎么加牛奶
ZmPYL9gene responds to drought stress and ABA induction,and ABA can increase the expression of this gene under drought stress.
Key words :Maize;Abscisic acid receptor;Constitutive expression;Drought stress;ABA induction
㊀㊀植物通过复杂的调控网络来应对干旱胁迫，如气孔关闭㊁诱导干旱响应基因应答等㊂其中，脱落酸
㊀第1期王延召等：玉米脱落酸受体ZmPYL9基因的克隆及功能探究
(ABA)作为重要的植物激素之一，参与植物多种生理过程，且对植物适应多种非生物胁迫具有重要的调控作用[1]㊂干旱胁迫刺激ABA的生物合成[2-3]，但是一直以来对ABA受体的研究较缓慢㊂RAZEM 等[4]通过放射性同位素方法验证了ABA与FCA蛋白的结合，但RISK等[5]研究证实FCA蛋白并不结合ABA㊂LIU等[6]研究表明,G蛋白偶联受体与ABA 结合[7]，但RISK等[5]质疑这一结论㊂PANDEY等[8]提出,GTGs膜蛋白可以结合ABA，但仍需要大量的代表性试验来证实㊂直到2009年,PYR1基因被鉴定出来，同时证明PYL蛋白与ABA结合，引起构型变化，从而抑制下游PP2C蛋白的磷酸化活性，进而调节植物的生长发育[9]；之后MA等[10]利用酵母杂交也筛选到可与HAB1(Protein phosphatase2C16)结合的PYL5㊁PYL6㊁PYL8蛋白㊂
PYL蛋白被证实是ABA的直接受体后，在拟南芥中鉴定出PYL蛋白家族有14个成员，被分为3个亚家族[11]，随后，在水稻[12]㊁草莓[13]㊁黄瓜[14]㊁玉米[15]中分别鉴定出12㊁9㊁11㊁13个PYL蛋白，参考拟南芥PYL蛋白家族成员分类将其分为3个亚家族㊂但不同PYL蛋白的存在形式不同,PYL4㊁PYL5㊁PYL6㊁PYL8㊁PYL9㊁PYL10等以单体形式存在，而PYL1㊁PYL2等以二聚体形式存在㊂在功能方面，拟南芥中已有报道，除AtPYL13外，其他基因均可激活植物体内ABA下游相关基因的表达[16]；此外，水稻上亦有报道,OsPYL能够正向调控ABA 信号，提高水稻抗旱和抗盐碱能力[17-18]㊂
玉米作为重要的粮食作物，经常受到干旱的影响，产量和粮食安全受到严重威胁㊂ABA在植物抵御逆境胁迫中具有重要功能，但目前对ABA受体PYL蛋白的功能报道多集中在拟南芥和水稻上，玉米上关于ABA和干旱胁迫诱导对PYL蛋白的影响报道甚少㊂鉴于此，以玉米为材料，克隆了一个PYL家族基因(Zm00001d010445)，暂时命名为ZmPYL9，分析ZmPYL9编码蛋白质的进化关系㊁表达模式及其对干旱胁迫和ABA诱导的响应情况，并了解该基因的启动子顺式作用元件，预测该基因特异结合目标靶基因的DNA片段等，旨在为PYL蛋白家族基因在玉米逆境胁迫和ABA传导中的作用研究提供参考，为抗逆性强的种质资源筛选提供依据，最终为挖掘抗旱优质资源㊁培育抗旱型玉米品种奠定基础㊂
1㊀材料和方法
1.1㊀材料及处理
试验材料为河南省农业科学院粮食作物研究所提供的抗旱性强的玉米自选系郑H71㊂取大田正常
生长的郑H71抽雄期的根㊁茎㊁芽㊁叶㊁雄穗㊁雌穗㊁
波克比怎么进化花粉㊁胚㊁胚乳，作为测定ZmPYL9基因时空表达的
样品㊂将郑H71籽粒播种于营养土，生长至一叶一
心时将幼苗从营养土中转移至Hoagland营养液(pH
值5.8)中，置于30ħ光照培养16h㊁26ħ暗培养8h，相对湿度为40%~55%的温室中进行水培㊂当郑H71长至三叶一心时，挑选长势一致的玉米苗分
别转移至以下营养液中进行处理:Hoagland营养液(CK)㊁Hoagland营养液+20%PEG㊁Hoagland营养液+100μmol/L ABA㊁Hoagland营养液+20%PEG+ 100μmol/L ABA，分别在处理6㊁12h时取各处理幼苗叶片，然后将各处理幼苗转移至新鲜的Hoagland 营养液中，恢复48h后再次取各处理幼苗叶片㊂以上所有大田和室内样品5株相同部位叶片混合为1个样品，每个样品3个生物学重复，且取样后迅速将其放入液氮，存于-80ħ超低温冰箱㊂
1.2㊀玉米总RNA提取及cDNA合成
利用EasyPure RNA Purification Kit提取郑H71每个样品的总RNA，然后根据TansScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis试剂盒说明书所提供的程序进行反转录，合成cDNA㊂
1.3㊀ZmPYL9基因cDNA的克隆
用BLAST在线工具搜索ZmPYL9基因序列，设
计特异扩增引物(ZmPYL9-F:5ᶄ-ATGGT-GGGTCTCGTCGGC-3ᶄ和ZmPYL9-R:5ᶄ-TCACT-GATCGATCAGCGACG-3ᶄ)，以反转录的cDNA为模板进行扩增，然后将扩增产物连接pMD19-T并转化大肠杆菌DH5α感受态，挑选阳性单克隆送武汉奥科鼎盛生物科技有限公司测序，并利用NCBI数据库比对测序结果㊂
1.4㊀ZmPYL9基因的生物信息学分析
使用在线工具MG2C绘画玉米数据库中的PYL基因在染体上的分布；利用在线EXPASY 中的Protparam对ZmPYL9基因所编码蛋白质的等电点(pI)㊁分子质量(MW)㊁稳定性㊁疏水性等属性进行计算；分别利用TMHMM Server和SOPMA 网站对ZmPYL9蛋白的跨膜结构和二级结构进行分析，使用ExPASy网站的NetPhoS预测ZmPYL9蛋白的磷酸化位点；采用Plantcare预测ZmPYL9基因启动子的顺式作用元件；利用MEGA软件中的NJ法构建ZmPYL9蛋白与其他物种同源蛋白质的系统发育树；使用MEME在线分析ZmPYL9蛋白的保守基序(Motif)，基序的最大数目设置为8㊂
91
河南农业科学
第49卷
1.5㊀ZmPYL9基因的表达分析
采用qRT -PCR 定量分析不同部位和不同处理玉米样品ZmPYL9基因的表达，设计基因序列特异荧光引物(ZmPYL9-QF:5ᶄ-TCGTCAAGCACAT-CAAGG -3ᶄ和ZmPYL9-QR:5ᶄ-AGGCCGGTCTT-GACGTTGA -3ᶄ)；以玉米18S 为内参，设计引物
18S1:5ᶄ-CCTGCGGCTTAATTGACTC -3ᶄ,18S2:5ᶄ-GTTAGCAGGCTGAGGTCTGG -3ᶄ㊂利用CFX96实时荧光定量PCR 仪(Bio -Rad,USA )，参考SYBR
Premix Ex Taq TM (TaKaRa,Japan)试剂盒程序，采用
两步法进行Real -time PCR㊂根据2
-әәCT
(әCT =
CT 目标基因-CT 内参基因,әәCT =әCT 处理后-әCT 对照)法进行数据处理㊂
2㊀结果与分析
香辣带鱼是哪个地方的菜2.1㊀PYL 基因家族在玉米染体上的分布
图1显示了PYL 家族基因在玉米10条染体上的定位㊂从图1发现，除了第7和第10染体
外,PYL 家族基因随机分布在8条染体上，没有特殊的染体偏好
㊂
图1㊀ZmPYL 基因家族在玉米染体上的分布
Fig.1㊀Distribution of ZmPYL gene family in maize chromosome
2.2㊀ZmPYL9基因的克隆和蛋白质结构分析
利用RT -PCR 技术扩增ZmPYL9基因，得到大小为600bp 左右的特异条带(图2)，回收并测序㊂
分析测序结果发现，该序列包含一个完整的594bp
开放阅读框，编码197个氨基酸，与全基因组序列已经公布的玉米自交系B73的序列一致㊂
蛋白质结构分析发现,ZmPYL9分子质量为21.79ku，理论等电点为5.69,GRAVY 值为
-0.249，属于亲水性蛋白质；跨膜螺旋区分析结果
显示,ZmPYL9蛋白无跨膜结构域;SOPMA 预测显
示,ZmPYL9蛋白无规则卷曲(L)占35.53%,β折叠(E)占3.55%,α螺旋(H)占43.65%，该蛋白质结构以α螺旋为主;NetPhoS 分析显示,ZmPYL9蛋白含有8个丝氨酸磷酸化位点㊁8个苏氨酸磷酸化位点和2个酪氨酸磷酸化位点，说明ZmPYL9蛋白可能主要受丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶激活，从而调控下游靶基因的
表达，参与植物的生长发育㊁信号传导及逆境胁迫响应过程㊂
2.3㊀ZmPYL9蛋白的进化及保守基序分析
为了揭示玉米ZmPYL9基因的进化关系，利用
2
㊀第1期王延召等：玉米脱落酸受体ZmPYL9
基因的克隆及功能探究
M 为Trans5K DNA Marker，泳道1为ZmPYL9基因PCR 扩增产物
M is Trans5K DNA Marker,and lane 1is a PCR amplification
product of ZmPYL9gene
图2㊀ZmPYL9基因的cDNA 电泳结果
Fig.2㊀Electrophoresis result of the ZmPYL9cDNA
NJ 法构建ZmPYL9蛋白序列与其他单子叶和双子
叶植物同源蛋白质的进化树(图3)，分析发现,ZmPYL9蛋白与单子叶植物高粱同源蛋白质的进化关系最为紧密，与双子叶植物大豆和胡桃木的进化关系较远㊂为了进一步分析ZmPYL9蛋白及其他物种同源蛋白质的保守性，利用MEME 软件共鉴定了
8个保守基序㊂由图3可知，玉米与高粱不仅同源性较高，且在相同的氨基酸位置含有相同的6个保守基序；与大豆和胡桃木的进化较远，其含有的保守基序相差较大㊂说明进化关系密切的物种保守功能基序也较为一致
㊂
8种颜代表8个不同的保守基序;Zm00001d010445代表玉米;Sb09g006700代表高粱;Bradi2g32250代表二穗
短柄草;AT5G53160代表拟南芥;LOC Os05g12260代表水稻;Pavir.Ca00496代表柳枝稷;Seita.3G076200代表谷子;
Pahal.C00916代表胡桃木;Glyma07g06270代表大豆
Eight colors represent eight different conservative motifs;Zm00001d010445stands for Zea mays L.;Sb09g006700stands for
Sorghum bicolor (Linn.)Moench;Bradi2g32250stands for Brachypodium distachyum (L.)Beauv.;AT5G53160stands for
Arabidopsis ;LOC Os05g12260stands for Oryza latifolia Desv.;Pavir.Ca00496stands for Panicum virgatum Linn.;
Seita.3G076200stands for Setaria italica (L.)Beauv.;Pahal.C00916stands for walnut;Glyma07g06270stands for
Glycine max (Linn.)Merr.
图3㊀ZmPYL9蛋白与其他物种同源蛋白的进化树及保守基序
Fig.3㊀The phylogenetic tree and conserved functional motifs of the ZmPYL9and homologous proteins of other species
2.4㊀ZmPYL9基因启动子顺式元件分析
为了进一步解析ZmPYL9的潜在功能，分析
ZmPYL9基因ATG 上游2000bp 的顺式响应元件
(表1)，发现该基因含有多种功能元件，除了启动子
表1㊀ZmPYL9基因启动子顺式元件分析
Tab.1㊀The cis element analysis of ZmPYL9gene promoter
顺式元件名称Name of cis element 来源植物
Source plant 位点
Site
核心序列Signal sequence 功能
Function
ARE
Zea mays
709㊁1789㊁931AAACCA 厌氧诱导必备调节元件
AuxRR -core Nicotiana tabacum 1625㊁1630
GGTCCAT 参与生长素反应CGTCA -motif Hordeum vulgare 1212
CGTCA 参与茉莉酸甲酯反应DRE core Arabidopsis thaliana 1488㊁1765㊁1503
GCCGAC 响应干旱和盐胁迫ERE
Nicotiana glutinos 317ATTTCATA 响应非生物胁迫GC -motif Zea mays
1677CCCCCG 参与缺氧特异性诱导
STRE
Arabidopsis thaliana 1594㊁1733
AGGGG 参与胁迫响应TCA -element Nicotiana tabacum 256CCATCTTTTT 参与水杨酸反应AT1-motif Solanum tuberosum 1012AATTATTTTTTATT
参与光反应GA -motif Arabidopsis thaliana 1184
ATAGATAA 参与光反应Sp1
Oryza sativa
1540㊁1959㊁1739
GGGCGG
光反应元件
1
2
河南农业科学第49卷本身核心元件TATA-box㊁CAAT-box外，还包含如
ARE㊁AuxRR-core㊁CGTCA-motif㊁DRE core㊁ERE㊁GC-
motif㊁STRE㊁TCA-element等结合位点㊂其中,ARE和
GC-motif是厌氧诱导必不可少的响应元件;AuxRR-
core属于生长素响应因子，在胚乳㊁子叶和侧根发育中
起重要作用;CGTCA-motif和TCA-element参与茉莉
酸和水杨酸信号途径;DRE core㊁ERE和STRE响应多
种非生物胁迫㊂另外，还发现大量光刺激应答元件
(AT1-motif㊁GA-motif㊁Sp1)㊂推测ZmPYL9不仅响应
逆境胁迫和激素信号传导途径，可能还参与植物光合
作用和调控植物开花等光反应㊂
2.5㊀ZmPYL9基因的组织表达模式分析
为了解ZmPYL9基因的表达模式，利用qRT-
PCR分析该基因在不同组织中的表达情况(图4),
结果显示,ZmPYL9基因在根㊁茎㊁叶㊁雌穗㊁雄穗㊁花
粉㊁胚㊁胚乳中均有表达，但在胚乳中表达量最高，其
次是雄穗和根㊂可见,ZmPYL9基因属于组成型表
达基因，但在不同部位的表达量存在一定的差异
㊂
R.根;S.茎;L.叶;T.雄穗;E.雌穗;P.花粉;Eb.胚;Ed.胚乳R stands for root;S stands for stem;L stands for leaf;T stands for tassel;
E stands for ear;P stands for pollen;Eb stands for embryo
and Ed stands for endosperm
图4㊀ZmPYL9基因组织表达模式
Fig.4㊀Expression pattern of ZmPYL9gene in
different organs of maize
2.6㊀ZmPYL9基因对PEG胁迫和ABA诱导的响应模式
由图5可见,ABA诱导6㊁12h时,ZmPYL9表达量均高于CK，但恢复48h后ZmPYL9相对表达量低于CK;PEG和PEG+ABA胁迫6㊁12h时, ZmPYL9表达量均低于CK，但恢复48h后ZmPYL9表达量上升且PEG胁迫处理的ZmPYL9表达量远高于CK；同时发现,ABA+PEG胁迫较PEG胁迫提高了该基因的表达量，也就是说外源ABA可以提高干旱胁迫下ZmPYL9基因的表达量㊂说明ZmPYL9基因响应干旱胁迫和ABA诱导，且受ABA的正向诱导，受PEG和PEG+ABA胁迫的负向诱导
洗衣机十大品牌排名
㊂
鸣人vs鼬
图5㊀ZmPYL9基因响应干旱胁迫和ABA诱导模式
Fig.5㊀Expression pattern of ZmPYL9gene in
response to PEG and ABA
3㊀结论与讨论
玉米是重要的粮食㊁饲料㊁加工原料等，其需求量越来越大㊂近年来，干旱导致的玉米产量下降已成为急需解决的严峻问题㊂筛选抗旱玉米种质资源并挖掘其自身的抗旱优质分子资源是一条有效的解决手段㊂植物可通过ABA信号途径应对干旱胁迫，如关闭气孔㊁诱导干旱基因应答等方式㊂PYL基因作为ABA受体，直接影响ABA的生物合成㊂目前，关于玉米PYL家族基因的抗旱功能研究报道甚少，基于此，本研究克隆了一个ZmPYL9基因，编码197个氨基酸，蛋白质结构主要以α螺旋为主，且该蛋白质可能主要被丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶激活，从而调控下游靶基因的表达，参与植物的生长发育和逆境胁迫响应过程㊂系统进化及保守基序分析发现,ZmPYL9蛋白与高粱不仅同源性较高，且基序一致，进化关系较为紧密；与大豆和胡桃木的进化关系较远，含有的保守基序相差较大㊂说明物种间的进化关系与其保守功能基序较为一致㊂
本研究分析发现,ZmPYL9基因启动子区域存在多个顺式元件，说明ZmPYL9基因的表达可能受多种转
录因子的调控，且这些转录因子与多种信号途径相关㊂这些顺式元件包含生长素㊁茉莉酸㊁水杨酸等多种激素的应答元件，说明ZmPYL9基因的表达除响应ABA外，还受其他激素的调节，参与多种激素信号转导网络㊂但前人研究表明，与激素应答相关的顺式元件存在冗余的可能，这一结论在水稻和拟南芥上均有验证[19]㊂
本研究发现,ZmPYL9基因在玉米多个组织中均存在表达，说明该基因属于组成型表达基因㊂该结果与拟南芥AtPYL3㊁AtPYL10㊁AtPYL11㊁AtPYL12和AtPYL13的研究结论一致[20]，但与AtPYL8[21]不同㊂SAAVEDRA等[21]研究表明,AtPYL8基因表达
22

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。