真菌单模块非核糖体肽合成酶的基因组挖掘与天然产物研究
许蒙;陈锡玮;胡昌华
空调外机不转了怎么回事【摘 要】真菌非核糖体肽(nonribosomal peptides,NRPs)是一类重要的次级代谢产物,其中不乏结构和功能特殊、可作药用的化合物.本文介绍了组成非核糖体合成酶(nonribosomal peptide synthases,NRPSs)各结构域的功能,综述了已有报道的两种单模块非核糖体合成酶,即仅含有腺苷化结构域(adenylation domain,A结构域)、巯基化结构域(thiolation domain,T结构域)、硫酯酶结构域(thioesterase domain,TE结构域)的NRPSs:A-T-TE和仅含有腺苷化结构域、巯基化结构域、一个还原酶结构域(reductase domain,R结构域)的NRPSs:A-T-R的生物合成产物,并结合生物信息学分析推测了第3种含有腺苷化结构域、巯基化结构域、两个还原酶结构域的单模块NRPSs:A-T-R-R可能合成的产物结构.手机充值卡怎么用
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2018(043)006
【总页数】9页(P645-653)
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【关键词】真菌;次级代谢产物;结构域;单模块NRPSs
【作 者】许蒙;陈锡玮;胡昌华
【作者单位】西南大学药学院重庆药物过程与质量控制工程技术中心,重庆400715;西南大学药学院重庆药物过程与质量控制工程技术中心,重庆400715;西南大学药学院重庆药物过程与质量控制工程技术中心,重庆400715
【正文语种】中 文
qq 直播【中图分类】R9;Q559
微生物来源的天然产物在数量上仅次于植物来源的天然产物。在新药开发方式从化学合成转向生物合成的行业背景下，微生物以其具有易操作、生长迅速等特点，使其天然产物相较于植物来说更具开发价值[1]。微生物天然产物通常根据其生物合成途径被分为萜类、聚酮类、非核糖体多肽类和生物碱类[2]。非核糖体肽(nonribosomal peptides, NRPs)是由非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthases,NRPSs)催化，不经由核糖体途径合成的结构复类繁多的多肽类小分子量化合物[3]。
NRPSs是一类多功能蛋白复合体，能识别、激活转运氨基酸底物按特定顺序合成NRPs[4]。NRPSs由相互独立的模块串联而成，每一个模块负责向多肽产物上连接一个氨基酸，常规NRPSs模块化的装配方式和线性结构决定了每个模块与最终产物中聚肽骨架的结构单元是一一对应的[4-5]。单模块的NRPSs仅具有一个A-T-C模块，且通常会有功能域的缺失；多模块的NRPSs存在重复的A-T-C模块。多模块NRPSs所合成化合物分子量通常较单模块NRPSs所合成的化合物分子量更大；因其多种多样的组合方式，它所合成的分子结构也更加丰富多样。相较于大多数多模块的NRPSs而言，单/双模块的NRPSs有着更古老的起源、更为保守的结构域、更为稳定的结构，其结构域不仅在真菌中有很高的保守性且与细菌中NRPSs结构域更为相近[6]。虽然并不排除单模块NRPSs与其他酶协同作用的可能，但单模块NRPSs依旧相对简单，更适合作为对NRPSs酶类研究的切入点。几组单/双模块的NRPSs产物相较于多模块的NRPSs而言它们在细胞的代谢及存活中起着更为关键的作用[6]。例如，土曲霉中的Asp-melanin能够保证土曲霉不受到紫外线的伤害以及土壤阿米巴原虫的吞噬[7]。本文主要关注单模块NRPSs的研究进展。
1 非核糖体肽合成酶(NRPSs)各结构域功能介绍
NRPSs的各个模块由不同的功能域构成，每个功能域有各自不同的催化功能，例如：底物的识别、装载，肽键的形成，产物的解离等[5]。一个基本的模块通常包括3个催化结构域：缩合结构域(condensation domain, C结构域)、腺苷化结构域(adenylation domain,A结构域)、巯基化结构域/肽酰载体蛋白(thiolation domain, T结构域/peptidyl carrier protein, PCP)，但是单模块NRPSs通常缺失C结构域[8]。
C结构域通常在模块的氮端，约450个氨基酸，通常情况下它催化形成两个底物之间的酰胺键，缩合域将氨基酸或多肽从上游载体蛋白结构域转移到先前被加载到下游T的底物的氨基部分上，当C结构域为起始结构域时通常会有一个不与T结合的底物被利用起来。C结构域属于氯霉素乙酰转移酶超家族，该家族都含有HHXXXDG功能区[9]。在氯霉素乙酰转移酶中这个功能区中第二个组氨酸负责从氯霉素中提取一个质子促进亲核攻击进而导致酰基的转移，C结构域的作用应该与此相似[10]。C结构域反应机制如图1所示。
T结构域是NRPSs中最小的结构域，由70～90个氨基酸组成。T结构域蛋白结构与反应机制如图2所示。非核糖体肽合成基因簇中通常伴随有一个磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(phosphopantetheine transferase, PPTase)基因。PPTase通过将硫酸巯基乙胺(phosphop
antetheine, PP)活化T结构域，这一翻译后修饰将apo状态的载体蛋白转化为可与底物结合的holo状态的载体蛋白[11]。巯基化结构域中含有一个保守的丝氨酸位点，它是辅因子泛酰巯基乙胺与T结构域共价结合的结合位点。活化后，T结构域上的巯基通过一个氨基酸的羧基酯键共价结合氨基酸或肽底物，底物与磷酸巯基乙胺臂结合后应能与C结构域的活性位点结合[8]。
A结构域通常在模块的碳端，约500个氨基酸，它负责底物的活化和装载两个步骤的反应，属于腺苷酸合成酶家族。从A结构域的三级结构来看，它由一大一小两个部分组成，其活性位点在两个部分间的连接处[8]。A结构域识别特定的氨基酸，在ATP的作用下合成相应的氨酰-AMP而使氨基酸底物得到活化，酰胺-AMP与T结构域上的辅因子磷酸泛酰巯基乙胺(4-phos-phopantetheine, Ppant)的巯基结合形成氨酰-S-载体复合物[11]。A结构域反应机制如图3所示。
除了上述3个结构域之外，NRPSs还具有其他结构域：硫酯酶结构域(thioesterase domain, TE结构域)、差向异构酶结构域(epimerization domain, E结构域)、N-甲基转移酶结构域(N-methylation domain, M结构域)、还原酶结构域(reductase domain, R结构域)[8]。TE结构
医保卡和社保卡是同一张卡吗域通常存在于整个NRPS的最后，它作为水解酶或环化酶负责产物的解离产生链状或内酯及内酰胺的环化产物[12]。TE结构域约由300个氨基酸组成，它的一个丝氨酸残基与底物结合形成一个酰基酶中间体，在水作为亲核试剂的情况下水解产生链状化合物或者成环[13]。E结构域目前有两种：一种是将底物由L构型转化为D构型；一种将底物由D构型转化为L构型。E结构域通常在T结构域与C结构域之间，由约450个氨基酸组成。M结构域能在肽键的氮原子上加上一个甲基，从而赋予了肽键更多的稳定性。M结构域通常位于C结构域与A结构域之间，由约420个氨基酸组成。R结构域通常存在于无TE结构域的NRPSs末端，负责产物的释放，一般会得到碳原子端的醇或者醛，而不会得到羧酸。R结构域与短链脱氢酶同源性较高，约由280个氨基酸组成[14]。
图1 C结构域反应机制Fig. 1 Reaction catalyzad by the NRPS condensation domain
图2 T结构域蛋白结构及反应机制Fig. 2 Reaction catalyzad by the NRPS thioesterase domain梁衡的作品
图3 A结构域反应机制Fig. 3 Reaction catalyzad by the NRPS adenylation domain
2 NRPS：A-T-TE型蛋白合成产物研究
构巢曲霉(Aspergillus nidulans)是目前被研究得较多的真菌之一，它所产生的次级代谢产物terrequinone A具有抗肿瘤的功效。Terrequinone A的生物合成路径中涉及到5个蛋白(TdiA～TdiE)，其中负责母核结构合成的TdiA，为A-T-TE型单模块的NRPS。如图4所示，氨酸由TdiD转化为吲哚丙酮酸(indole pyruvic acid, IPA)，在TdiA的作用下两分子的IPA反应生成中间产物didemethylasterriquinone D,didemethylasterriquinone D在一系列后修饰的作用下合成terrequinone A[15]。但TdiA并不是构巢曲霉中唯一的单模块NRPS，基因组分析显示该基因组中共有14个编码单模块NRPS的基因。通过更换原有启动子的方式对其他13个基因进行激活，其中的12个基因在此操作后对构巢曲霉次级代谢产物的产生并未产生影响，但基因AN3396.4的激活导致microperfuranone的产量提高了，后续在黑曲霉(Aspergillus niger)中的异源表达实验证明AN3396.4是负责microperfuranone合成的唯一基因[16]。Microperfuranone具有抗菌活性，对大肠埃希菌(Escherich coli)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、黄瓜萎蔫病菌(Plectosphaerella cucumerina)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissime PH30016)、青48(Fusarium flocciferum PH30048)的最低抑菌浓度分别为512、256、128、64和128μg/mL[17]。
图4 Terrequinone A合成路线图Fig. 4 Biosynthetic pathway of terrequinone A
图5 Aspulvinone、butyrolactone IIa、phenguignardic acid及化合物1结构式Fig. 5 Chemical structure of aspulvinone, butyrolactone IIa, phenguignardic acid and compound 1
土曲霉(Aspergillus terreus)的基因组分析显示，它包含15个编码单模块NRPS的基因，其中5个已被研究的基因编码的蛋白：AtqA、ApvA、BtyA、AtmelA和PgnA属于A-T-TE结构类型。AtqA、ApvA和AtmelA合成aspulvinone E；BtyA合成butyrolactone IIa；PgnA合成phenguignardic acid[7,18-20]。各化合物结构如图5所示。将pgnA克隆到构巢曲霉中表达的结果表明pgnA是负责合成phenguignardic acid的唯一基因[19]。Phenguignardic acid具有抗菌活性、细胞毒性且为一个植物性毒素[21-22]。apvA和atmelA分别位于土曲霉的III、IV号染体上，异源表达的结果表明他们合成相同的化合物。ApvA和AtmelA分别在土曲霉的菌丝和孢子中表达合成aspulvinone E，继而在菌丝中合成aspulvinone类化合物，与此同时在分生孢子中合成黑素，这种差异可能是由于他们自身启动子的不同造成的[18]。AtmelA和TyrP在产孢条件下共表达，AtmelA由TyrP(酪氨酸酶)活化后合成aspulvinone E，aspulvinone E自发的合成黑素aspmelanin。Asp-melanin能够保证土曲霉的分子受到紫外线的伤害以及土壤阿米巴原虫的吞噬，且aspmelanin不抑制溶酶体的酸化，这可能使得
土曲霉的孢子能在酸性的环境条件下生存[7]。以aspulvinone E和butyrolactone IIa为母核结构合成的丁酰内酯类化合物大多具有抗菌活性和细胞毒性，aspulvinone类化合物还是荧光素酶抑制剂，特别值得一提的是isoaspulvinone E具有抗甲型H1N1流感病毒活性[23-25]。上述5个NRPSs所识别的底物均不是氨基酸而是α-酮酸，这应该是NRPS中A结构域识别活化特异性底物的结果。通过在构巢曲霉中异源表达，对apvA、btyA和pgnA的分析表明，将apvA的A结构域替换到btyA中A结构域的区域及将apvA的A-T结构域替换到btyA中A-T结构域的区域中均能得到butyrolactone IIa；将pgnA的A结构域替换到btyA中A结构域的区域及将pgnA的A-T结构域替换到btyA中A-T结构域的区域中均能得到新的化合物1。这表明底物的识别是由A结构域完成的，二聚过程中五元环的成环方式是由TE结构域决定的，此研究为在真菌中定向合成NRPs化合物提供了参考[20]。
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