南京农业大学学报2021,44(1) ：160-168
Journal of Nanjing Agricultural University http ://nauxb.njau.edu DOI ：10.7685/jnau.201912021于昊，李曼曼，薛洋，等.毛喉素诱导猪卵泡颗粒细胞体外分化机制的研究[J].南京农业大学学报,2021,44(1):160-168.Y U Hao , LI Manman ,XUE Yang , et al. Mechanisms of in vitro differentiation induced by forskolin in porcine follicular granulosa cells [J]. Journal of Nanjing Agricultural University ,2021,44(1) : 160-168.
毛喉素诱导猪卵泡颗粒细胞体外分化机制的研究
于昊，李曼曼，薛洋，姜志洋，茆达干*
(南京农业大学动物科技学院家畜繁殖研究室/动物科学类国家级实验教学示范中心，江苏南京210095)摘要：［目的］本试验旨在研究毛喉素(FSK)对体外培养的猪卵泡颗粒细胞分化的作用及机制。［方法
］体外分离培养猪原 代卵泡颗粒细胞，预培养24 ho 用10 nmol-L -1 FSK 处理细胞48 h，检测细胞形态、脂滴积聚、标记基因和周期相关基因表达 状况；处理96 h 后检测孕酮(P *)水平及类固醇合成相关蛋白的表达水平。［结果］与对照组相比,FSK 改变了细胞形态，使 细胞直径增大，细胞内脂滴含量增加(P <0.01) ; FSK 降低细胞的增殖活性和增殖细胞核抗原(PCNA )基因表达水平(P < 0.01);FSK 降低颗粒细胞标记基因促卵泡素受体(FSHR)基因表达水平，提高黄体细胞标记基因前列腺素受体(PTGFR)和 促黄体素受体(LHCGR)基因表达水平(P <0.01) ;FSK 促进P 4分泌，提高了类固醇合成相关蛋白和30-HSD 的表达水平(P <0.01)；从细胞周期看,FSK 降低了细胞周期素B1( CCNB1 )、细胞周期素D1( CCND1)和细胞周期蛋白依赖 性激酶1( CDK1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2( CDK2)基因表达水平(P <0.01)，而使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A/B (P21cip1/P27kip1)基因表达水平上调(P <0.01)，并将细胞周期阻滞在G0/G1期。［结论］FSK 能够通过抑制细胞增殖、增强 脂滴积聚和孕酮合成代谢以及退出细胞周期来促进颗粒细胞向黄体细胞转化。
关键词：毛喉素；猪；卵泡；颗粒细胞；分化；细胞周期
中图分类号:S814.1 文献标志码:A 文章编号：1000-2030( 2021) 01-0160-09
Mechanisms of in vitro differentiation induced by forskolin
in porcine follicular granulosa cells
中国十大热门专业YU Hao , LI Manman , XUE Yang ,JIANG Zhiyang , MAO Dagan *
(Animal Reproduction Laboratory,College of Animal Science and Technology/National Experimental Teaching
Demonstration Center of Animal Science ，Nanjing Agricultural University ，Nanjing 210095，China)
Abstract : [ Objectives] The aim of this study was to investigate the effect and mechanisms of forskolin(FSK) on the differentiation of porcine follicular granulosa cells(GC)in vitro. [Methods]Primary porcine follicular GC were isolated and cultured for 24 h ,and then 10 nmol<L -1 FSK was added into the culture media. 48 h later ，the cell morphology ，lipid drops( LD) and the expression level of marker and cell cycle relative genes were evaluated ； 96 h later , the progesterone (P 4) level and steroidogenic proteins were measured. [ Results ] Compared with the control group ， FSK changed the morphology of GC ，enlarged cells size and increased LD content ( P < 0.01) . FSK decreased the cell viability of proliferation and the gene expression level of proliferating cell nuclear antigen( PCNA ) ( P <0.01) . FSK decreased the gene expression level of follicle-stimulating hormone receptor( FS
HR) (P <0.01)which was the marker gene of GC ,w-hile FSK up-regulated the gene expression levels of prostaglandin receptor( PTGFR ) and luteinizing hormone receptor( LHCGR ) ( P <0.01), ■which were the marker genes of luteal cells. The expression levels of P 4, steroidogenic acute regulatory protein ( StAR ) , cytochrome P450 side-chain cleavage enzylne(P450soo)and 30-hydroxysteroid dehydrogenase(30-HSD)significantly increased after FSK treatment ( P <0.01) . For cell cycle ，the gene expression levels of cyclin B1( CCNB 1) ，cyclin D1( CCND 1) ，cyclin-dependent kinase 1( CDK 1) and cyclin-dependent kinase 2 ( CDK 2) significantly decreased ( P < 0. 01) ， while gene expression levels of cyclin-dependent kinase inhibitor 1A/B( P21eip1 /P27kip1) significantly increased in the FSK group( P <0.01). At the same time , FSK treatment induced cell cycle arrest in the G0/G1 phase. [ Conclusions] FSK could change the morphology of GC , inhibit cell proliferation , enhance LD aggregation and P 4 anabolism ，and promote GC exit from cell cycle and then differentiate into luteal cells.
Keywords :forskolin ；pig ；follicular ；granulosa cells ；differentiation ；cell cycle
卵巢黄体是成熟卵泡排卵后形成的一个暂时性内分泌腺体，对卵巢周期性调节和妊娠维持具有重要 作用。卵泡排卵后，颗粒细胞逐渐分化成大黄体细胞，与卵泡内膜细胞分化成的小黄体细胞一起构成黄
体 收稿日期：2019-12-12
基金项目：国家自然科学基金项目(31501956)
作者简介：于昊，硕士研究生;*通信作者：茆达干，教授，博士，主要从事动物生殖生理与调控研究,E-mail : maodagan©
第1期于昊，等：毛喉素诱导猪卵泡颗粒细胞体外分化机制的研究161
的重要组成部分［1］。分化的颗粒细胞主要分泌孕酮(progesterone,PJ以维持黄体的功能，然而由于某些原因未排卵的颗粒细胞亦会黄素化引起黄体囊肿从而引起繁殖障碍。因此研究颗粒细胞的正常分化对揭示黄体形成的分子机制具有重要意义。
毛喉素(forskolin,FSK)作为腺苷酸环化酶(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的激动剂可增加胞内cAMP浓度［2］，激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)参与细胞代谢的多种过程［3］。研究表明，FSK可通过PKA下游的cAMP效应兀件结合蛋白(cAMP-response element-binding protein,CREB)和Epac1-Rap1信号诱导小鼠巨噬细胞增殖［4］;FSK还可以上调未成年大鼠卵泡颗粒细胞雌激素0亚型受体［5］，提示FSK有利于颗粒细胞的增殖代谢。Shrestha等［6］发现,FSK诱导的cAMP升高激活了纤维生长因子2并维持牛颗粒细胞的增殖和存活。Bahmanpour等［7］发现，在与颗粒细胞共培
养的小鼠胚胎干细胞中加入FSK 可以促进胚胎干细胞向生殖样细胞分化;FSK还可以通过减少抗凋亡蛋白加速乳腺癌细胞的凋亡⑻。
鉴于复杂的生物学功能,FSK在细胞培养中广泛应用于促进细胞的增殖、分化或凋亡，而FSK对猪卵泡颗粒细胞分化的分子机制未见详细报道。本试验通过FSK处理体外培养的猪卵泡颗粒细胞，研究其对细胞分化及细胞周期等的影响，为颗粒细胞体外分化模型的建立提供新方法，为研究卵巢卵泡-黄体转化的分子机制提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
试验所用卵巢从当地屠宰场采集。FSK(F6886)购自Sigma公司；M199培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)、胰蛋白酶和青(链)霉素购自Wisent公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；油红0试剂盒、CCK-8试剂盒购于Solarbio公司；放射免疫试剂盒购于北方生物技术研究所;RNA提取试剂盒购于TaKaRa公司；RT-qPCR试剂盒购于Vazyme公司。鉴定所用的颗粒细胞标记物促卵泡素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)(A3172)抗体购于AB clonal公司。Western blot试验所用StAR(A1035)和3p-HSD(A1823)抗体购于AB clonal公司,P450scc(DF6569)抗体购于Affinity公司,ATF3(SC-81189)抗体购于Santa Cruz公司,a-Tubulin(ABM-0010)抗体购于南京钟鼎生物技术有限公司。
1.2方法
1.2.1颗粒细胞的分离、培养与鉴定从南京某屠宰场采集母猪卵泡期卵巢，保温并2h内带回实验室。选取中等大小(直径5~8mm)的卵泡抽取卵泡液。1000r-min-1离心5min后用M199基础培养基洗涤细胞沉淀3次，完全培养基(含M199基础培养基、5%FBS、100pg-mL-1双抗)调整细胞含量为1x106mL-1，接种于T75培养瓶，置于37V,5%CO2培养箱中培养过夜。第2天更换新鲜培养基，除去红细胞、卵母细胞及死细胞等不贴壁细胞。每隔1d更换培养基，待细胞汇合度达70%时传代培养。参照Yousefi等⑼方法进行免疫荧光染鉴定。封片后于荧光倒置显微镜(Axiovert40C/CFL,Zeiss)下观察染情况。
1.2.2FSK作用浓度的筛选FSK用1mL二甲基亚砜(DMSO)配成储存浓度，试验前用完全培养基稀释成工作浓度。将处于对数生长期的细胞传代，重新接种于96孔细胞培养板中，待细胞汇合度达到90%时，用不同浓度(0、0.1、1、10、100pmol・L-1)FSK处理24h。CCK-8法检测各组细胞的存活率。
1.2.3试验分组与处理将细胞分为2组，每组至少3个重复。空白对照(CON)组:M199完全培养基培养细胞;FSK处理(FSK)组：先用M199完全培养基培养细胞24h，再用10pmol-L-1FSK处理细胞。
1.2.4油红O染具体步骤按照油红0染试剂盒(G1262)说明书。染完成后用纯异丙醇萃取油红0染液，酶标仪(Multiskan Fc,Thermo Fisher公司)测定510nm处的吸光值(4510)。
1.2.5CCK-8法测定细胞活力将细胞重悬后铺至96孔板中，待4h细胞贴壁后，加入FSK分别处理0、24、48、72、96,120h后，每孔加入10pL CCK-8溶液，置于培养箱中孵育4h，酶标仪测定450nm处的吸光值(人450)。
牛肝1.2.6放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)测定P4含量分别收集FSK处理不同时间(0、24、48、72、96h)的细胞培养上清液，应用RIA-P4试剂盒(S1*******)检测P4含量。
1.2.7Western blot检测蛋白的表达具体步骤参照Bond等［10］的方法。检测类固醇合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)、胆固醇侧链断裂酶(cytochrome P450side-chain cleavage enzyme,P450scc)、30-羟基类固醇脱氢酶(30-hydroxysteroid dehydrogenase,30-HSD)和转录激活因子3qq同步
162南京农业大学学报第44卷（activating transcription factor 3 , ATF3）蛋白的表达水平，以a-Tubulin 为内参蛋白。Image J 软件分析条带 的灰度值。
1.2.8 RT-qPCR 检测基因的表达 在NCBI 网站查相关基因序列，利用Primer Premier 6.0软件设计基 因引物（表1）o 参照RNA 提取试剂盒（9108）说明书提纯RNA ，用反转录（RT ）试剂盒（R212-01）反转录 成cDNAo 用qPCR 试剂盒（R222-01）检测相关基因表达水平。以GAPDH 为内参基因，反应产物经熔解 曲线检测特异性。用2-AA C t 法计算目的基因的相对表达量。
怎么把ie设置为默认浏览器表1 qPCR 所用引物序列
Table 1 Primer sequences for quantitative real-time PCR
基因Gene
基因序列号GenBank ID 引物对序列 Primer pairs sequences (5'—3/)PCNA
NM_001291925.1CDK1XM_005671013.3
CDK2XM_005655594.2
CDK4NM_001123097.1
意思相反的四字词语CCNB1NM_001170768.1CCND1
XM_021082686.1CCNE1XM_005653265.2P21c ip1
NM_001243602.1P27kip1
NM_214316.1PTGFR XM_005665359.3
LHCGR XM_021085886.1
FSHR XM_021085881.1GAPDH NM 001206359.1CAGCTCCAGCGGCGTGAAC/CGCAGCGGTACGTGTCGAAG AGTGTGGCCAGAAGTGGAGT/TCGAGAGCAGATCCAAGCCA AAGATGGACGGAGCTTGTTATCGC/CTGGCTTGGTCACATCCTGGAAG CGGAGATTGGTGTTGGTGCCTATG/CCATTGGGGACTCTTACGCTCTTG CGCCCTCTACCCCTGCATTTTC/GCTCCTGCTGCGATCTGAGAAG
GCTCGCCCTCCGTGTCCTAC/TCGCAGACCTCCAGCATCCAG TGCCGAGGGAGAAGAAGGAAAGG/GGAGCGAACAGAGACATCAGTGC
GCTGAGCCTGCTTGATGACA/CACCTGGCTAAGCTGAGTGC TTGGGTCTCAGGCCAACTCA/AGGAATCGTCTGTGGCAGGT AAGTCAGCAGCACAGACAAGGC/AACGCAGGAGACGCACATTATAGC GTATATTGAGCCTGGAGCAT/ACGGTGGTTATGTGTAAGTT CAGTCGCCCTCTTTCCCATCTTTG/GCCAGGACATTGAGCACAAGGAG
GTGAAGGTCGGAGTGAAC/GGTGGAATCATACTGGAACA 注:PCNA ：增殖细胞核抗原 Proliferatin
g cell nuclear antigen ； CDK1：细胞周期蛋白依赖性激酶 1 Cyclin-dependent kinase 1 ； CDK2：细胞周 期蛋白依赖性激酶2 Cyclin-dependent kinase 2； CDK4：细胞周期蛋白依赖性激酶4 Cyclin-dependent kinase 4；CCNB1：细胞周期素B1 Cyclin B1；CCND1：细胞周期素D1 Cyclin D1；CCNE1 ：细胞周期素E1 Cyclin E1；P21呷1 ：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A Cyclin- dependent kinase inhibitor 1A ；P27kip 1 ：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 1B Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B ；PTGFR ：前列腺素 F2a 受体 Prostaglandin F2a receptor ； LHCGR ：促黄体素受体 Luteinizing hormone receptor ； FSHR ：促卵泡素受体 Follicle-stimulating hormone receptor ；GAPDH ：油醛-3-磷酸脱氢酶 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.下同。The same below.
1.2.9细胞发育周期的流式细胞术测定 收集1x106mL -1单细胞悬液1 mL，参照细胞周期检测试剂盒（KGA511）说明书处理细胞，设定流式仪（FACSCalibur,B&D 公司）参数并检测细胞的周期
1.3数据的统计分析
采用SPSS 24.0软件对数据进行方差分析和差异显著性检验。所有试验至少重复3次，数据均用平 均值土标准误（%±SE ）表示。
2结果与分析
2.1猪卵泡颗粒细胞培养与鉴定
FSHR 是猪卵泡颗粒细胞特异性表达的蛋白，采用免疫荧光染法对所培养的细胞进行鉴定。如图1 所示：绿荧光为FSHR 的特异性表达（图1-a ）；蓝荧光为细胞核（图1-b ）o 视野中超过90%细胞的 FSHR 表达为阳性，说明分离培养的细胞为颗粒细胞。
图1猪卵泡颗粒细胞促卵泡素受体(FSHR )的免疫荧光鉴定
Fig. 1 Identification of porcine follicular granulosa cells follicle-stimulating hormone receptor (FSHR )
by immunofluorescence
a.促卵泡素受体荧光染 Fluorescence staining of FSHR ；
b.细胞核 DAPI 染 DAPI staining of nucleus ；
c.合成图 Merged
graph.
第1期于昊，等：毛喉素诱导猪卵泡颗粒细胞体外分化机制的研究163
2.2不同浓度FSK 对颗粒细胞活力的影响
如图2所示：用不同浓度FSK 处理颗粒细胞24 h，当 FSK 浓度为0.1~10 pmol - L -1时，细胞存活率与对照组无 显著差异（P >0.05）；当FSK 浓度为100 pmol-L -1时，细胞 存活率显著低于对照组（P <0.05），故选择10 pmol-L -1为 本试验的FSK 作用浓度。2.3 FSK 对颗粒细胞形态的影响如图3所示：对照组细胞（正常颗粒细胞）与成纤维 样细胞形态相似，细胞狭长，排列紧密，呈流线或放射状 （图3-a ）；10 pmol-L -1 FSK 处理组细胞与上皮样细胞形 态类似，细胞呈扁平不规则的多角形或星形（图3-b ）o
对照组直径13~20 pm 的细胞较多，约占58% ； FSK 组直 径21~28 pm 和29~40 pm 的细胞较多，共约占细胞总数 52%（图3-c ）。说明FSK 改变颗粒细胞形态及大小。20O @u
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is s ffi 2000806040图2 FSK 浓度对猪卵泡颗粒细胞活力的影响
Fig. 2 Effects of FSK concentration on the viability of porcine follicular granulosa cells P<0.05.
□ 5〜12 pm ；■ 21~28 gm;o o o o o o 0 8 6 4 2 1A UOPJOdoJd I I Q O -一-□ 13~20 pm ；□ 29-40
分组Groups
F s K 图3 10 pmol-L '1 FSK 对猪卵泡颗粒细胞形态的影响
Fig ・ 3 Effects of 10 pmo b L "1 FSK on the morphology of porcine follicular granulosa cells a.对照组细胞形态 Cell morphology in control group ； b. FSK 处理组细胞形态 Cell morphology in FSK group ；c.细胞大小统计 Cell size statistics 。CON ：对照组 Control group ；FSK : 10 pmol • L -1 FSK 处理组 10 pmol • L -1 FSK-treated group o 下同 The same below.2.4 FSK 对颗粒细胞脂滴含量的影响
用油红0鉴定细胞中脂滴含量的结果显示：对照组颗粒细胞内脂滴含量较少（图4-a ），而FSK 处理 颗粒细胞48 h 后，可观测到细胞内脂滴数量较对照组明显增多（图4-b ）。脂滴定量结果（图4-c ）显示：与对照组相比,FSK 处理组细胞内脂滴含量极显著增加（P<0.01）
图4 FSK 对猪卵泡颗粒细胞脂滴积聚影响的油红O 染鉴定
Fig. 4 The oil red O staining for identification of the effects of FSK on the lipid drops
aggregation of porcine follicular granulosa cells
a.对照组 Control group ；
b. FSK 处理组 FSK group ；
c.脂滴含量比较 Lipid drop content comparation.
Nucleus ：细胞核；LD ：脂滴 Lipid drops. ** P<0.01.下同 The same as follows.
2.5 FSK 对颗粒细胞增殖活性的影响
与对照组（0 h ）相比，FSK 处理24 h 后，细胞的增殖活性无显著变化（P >0.05）；而FSK 处理48 h 以 后，细胞增殖活性与对照组相比均极显著降低（P <0.01，图5-a ）。RT-qPCR 结果（图5-b ）显示:FSK 处理 细胞48 h 后，FSK 组增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen , PCNA ）基因表达量极显著低于对照 组（P <0.01）
。
164
南 京 农 业 大 学 学 报第 44 卷a B s q
-S A I R D .5.O .5O
1 1
o
分组Groups
多媒体技术的特点图5 FSK 对猪卵泡颗粒细胞增殖活力的影响
Fig. 5 Effects of FSK on the cell viability of proliferation of porcine follicular granulosa cells a. CCK-8试剂盒检测细胞增殖活力Cell viability detected by CCK-8 kit ；b. RT-qPCR 检测PCNA 基因相对表达量 Relative gene expression level of PCNA detected by RT-qPCR.
2.6 FSK 对颗粒细胞孕酮分泌及类固醇合成相关蛋白表达的影响
用RIA 检测细胞培养上清液中P 4含量，结果（图6-a ）显示：与对照组（0 h ）相比,FSK 处理颗粒细胞 48 h 后，培养上清液中P 4含量均极显著增加（P<0.01）。应用Western blot 检测细胞中类固醇合成相关蛋 白表达水平，结果（图6-b ）显示:FSK 处理颗粒细胞24 h 起,StAR 、3B-HSD 蛋白水平相较于对照组均极显 著增加；FSK 处理颗粒细胞48 h 起,P450scc 蛋白水平相较于对照组均极显著增加（P <0.01）。
247296StAR P450scc
3p-HSD t/h ^480O
1S A O I U
O
H
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S
a
l
d
x
Q
Q 启
gojd *芻*衩異m w t/h
a-Tubulin IQ A U I
u
.2ssaldx 。QAg&ISI .93O J J
o t/h t/h
图6 FSK 对猪卵泡颗粒细胞孕酮（P 4）分泌（a ）及类固醇合成相关蛋白表达（b ）的影响Fig. 6 Effects of FSK on progesterone （P 4） level （a ） and steroidogenic proteins expression level （b ） of
porcine follicular granulosa cells
StAR ：类固醇合成急性调节蛋白 Steroidogenic acute regulatory protein ； P450so.c ：胆固醇侧链断裂酶 Cytochrome P450 side-chain cleavage enzyme ；30-HSD ：30-羟基类固醇脱氢酶 30-hydroxysteroid dehydrogenase.
2.7 FSK 对标记基因表达的影响
应用RT-qPCR 检测颗粒细胞标记基因FSHR 和黄体细胞标记基因PTGFR 、LHCGR 的表达水平。结 果（图7-a ）显示：与对照组相比,FSK 处理48 h 后,FSHR 基因表达水平极显著降低,PTGFR 和LHCGR 基
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