新冠标本的采集运送实验室核酸检测技术报告
新冠标本的采集运送实验室核酸检测技术报告
目的：为全面掌握新冠病毒核酸检测方法，快速准确开展核酸检测，为疫情防控和临床提供可靠的实验室数据及判定标准。
方法：新冠标本的采集、运送、实验室检测、结果报告
1.新冠标本的采集
1.1 鼻咽拭子∶采样人员一手轻扶被采集人员的头部,一手执拭子,拭子贴鼻孔进入,沿下鼻道的底部向后缓缓深入,由于鼻道呈弧形,不可用力过猛,以免发生外伤出血。待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时轻轻旋转一周(如遇反射性咳嗽,应停留片刻),然后缓缓取出拭子,将拭子头浸入含2~3ml病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液)的管中,尾部弃去,旋紧管盖。
1.2 咽拭子:被采集人员先用生理盐水漱口,采样人员将拭子放入无菌生理盐水中湿润(禁止将拭子放入病毒保存液中,避免抗生素引起过敏),被采集人员头部微仰,嘴张大,并发“啊”音,露出两侧扁桃体,将拭子越过舌根,在被采集者两侧扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次,然后再在咽后壁
上下擦拭至少3次,将拭子头浸入含2~3m病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液的管中,尾部弃去,旋紧管盖。咽拭子也可与鼻咽拭子放置于同一管中。
1.3 鼻咽抽取物或呼吸道抽取物:用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管,接通负压,旋转收集器头部并缓慢退出,收集抽取的料管中。
1.4 物体表面标本:参考《农贸(集贸)市场新型冠状病毒环境监测技术规范》WS/T776-2021)推荐的方法,采样拭子充分浸润病毒保存液后在表面重复涂抹,将拭子放回采样管浸润,取出后再次涂抹采样,重复3次以上。
1.5 用于病毒分离和核酸检测的标本应当尽快进行检测,可在24小时内检测的标本可置于4℃保存;24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存(如无-70℃保存条件,则于-20℃冰箱暂存)。血清标本可在4℃存放3天,-20℃以下可长期保存。应当设立专库或专柜单独保存标本。
2.标本的运送
2.1 标本送检 标本采集后应当尽快送往实验室,标本采集后室温(25℃)放置不宜超过4小时。如果需要长途运输,建议采用干冰等制冷方式进行保藏。标本运送期间应当避免反复冻融。
2.1.1上送标本：各省(自治区、直辖市)发现的本土疫情中的的首发或早期病例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来源不明的本土病例、输入病例、入境物品及相关环境阳性标本等所有原始标本应平行采集至少2份,一份送各省级疾控机构进行检测,另一份上送中国疾控中心进行检测
2.2 标本及毒株运输
2.2.1国内运输新冠病毒毒株或其它潜在感染性生物材料的运输包装分类属于A类,对应的联合国编号为UN2814,包装符合国际民航组织文件DoC9284《危险品航空安全运输技术细则》的P|620分类包装要求;环境样本属于B类,对应的联合国编号为UN3373,包装符合国际民航组织文件DoC9284《危险品航空安全运输技术细则》的P650分类包装要求;通过其他交通工具运输的可参照以上标准包装。新冠病毒毒株或其它潜在感染性材料运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》(原卫生部令第45号)办理《准运证书》；
2.2.2 国际运输在国际间运输的新冠病毒标本或毒株,应当规范包装,按照《出入境特殊物品卫生检疫管理规定》办理相关手续,并满足相关国家和国际相关要求。
2.2.3 标本和毒株的接收及管理通过航空进行运送的标本抵达目的地机场后,由专业运输车辆运送至接收单位,通过陆路运输的标本由专业车辆进行运送,运送人员和接收人员应对标本进行双签收，新冠病毒标本及毒株应由专人管理,准确记录标本及毒株的来源、种类、数量,编号登记,采取有效措施确保毒株和样本的安全,严防发生误用、恶意使用、被盗、被抢、丢失、泄露等事件。
3.新冠病毒的实验室检测
3.1检测人员要求：实验室检测技术人员应当具备实验室工作经历以及相关专业技术技能,接受过新冠病毒相关检验检测技能培训。检测机构应当按照所开展检测项目及标本量配备实验室检测人员,以保证及时、高效完成检测和结果报告。新冠病毒标本及毒株应由专人管理,准确记录标本及毒株的来源、种类、数量,编号登记,采取有效措施确保毒株和样本的安全,严防发生误用、恶意使用、被盗、被抢、丢失、泄露等事件。
3.2 实验室检测
3.2.1 实时荧光RT-PCR方法检测新冠病毒核酸。
3.2.2 新冠病毒核酸的荧光定量RT-PCR检测，实验室应当制定标准操作程序(SOP),并严格按照SOP进行操作。接到标本后,应当在生物安全柜内对标本进行清点核对,并依据SOP进行试剂准备、标本前处理、核酸提取、核酸扩增、结果分析及报告。实验室应当建立可疑标本复检的流程。
3.2.3 试剂准备：应当选择国家药品监督管理部门批准的试剂,建议选择磁珠法、膜吸附法等进行核酸提取,建议根据核酸提取试剂及扩增体系的要求选择配套的标本采样管,不建议免提取核酸直接进行核酸扩增反应。
3.2.4 标本处理：使用含胍盐等灭活型采样液的标本无需进行灭活处理,可直接进行核酸提取,而使用非灭活型采样液的标本,按照核酸提取试剂盒的说明,取适量标本加至核酸提取裂解液中充分混匀作用一定的时间则可以有效灭活病毒。不推荐采用56℃孵育30分钟的处理方式灭活病毒,该条件不能保障充分灭活病毒。污水样本处理可参考《农贸(集贸)市场新型冠状病毒环境监测技术规范》(WS/T76—2021)推荐的方法。
3.2.5 核酸提取：将灭活后的标本取出,在生物安全柜内打开标本采集管加样。或按照核酸提取试剂盒的说明,将标本与裂解液作用足够时间后继续核酸提取步骤,核酸提取完成后立即封盖。取适量核酸加至PCR扩增反应体系中。
3.2.6 核酸扩增：将扩增体系放入荧光定量PCR仪,按照试剂盒说明书设置扩增程序,启动扩增程序。扩增完成后反应管不可开盖,直接放于垃圾袋中,封好袋口,不可高压,按般医疗废物转移出实验室处理。
4.检测结果判定
4.1 结果判断：阴性:无Ct值、无S形扩增曲线。阳性:Ct值小于等于检出限,且有S形扩增曲线可报告为阳性。灰区:Ct值位于灰区,建议重复实验,若重做Ct值仍处于灰区,但出现明显的S形扩增曲线,该样本判断为阳性,否则为阴性。注:如使用商品化试剂盒,则以厂家提供的说明书为准。手机查核酸报告查询
4.2 实验室确认：阳性病例需满足以下两个条件中的一个:条件一:同一份标本中新冠病毒2个靶标(ORF1ab、N)实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测
结果,则需要重新采样,重新检测。条件二:两种标本实时荧光RT-PCR同时出现单靶标阳性,或同种类型标本2次采样检测中均出现单个靶标阳性的检测结果,可判定为阳性。环境与生物材料核酸检测阳性要排除疫苗接种物残留污染的影响。核酸检测结果假阴性的可能原因包括:样本质量差;样本采集时间过早或过晚;样本保存、运输和处理不当;其他原因如病毒变异、PCR抑制等。
4.3 质控：由上级疾控部门对下级疾控实验室进行核酸检测质控考核,中国疾控中心每年至少开展一次对省级疾控机构实验室的质控考核,并同时提供全国新冠病毒实验室检测质控方案,省级针对地市级实验室的质控考核每年不少于2次。各检测机构应当加强核酸检测质量控制,选用扩增检测试剂盒指定的核酸提取试剂和扩增仪。
讨论 严格控制各环节的污染，严格控制污染是保证实验结果真实性，准确性可靠性的最关键环节，我们务必高度重视。
参考文献 中国疾病预防控制中心《新冠防控实施指南》

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