第31卷 第3期
V o l .31 N
o .3草 地 学 报
A C T A A G R E S T I A S I N I C A
2023年 3月
M a r . 2023
d o i :10.11733/j
.i s s n .1007-0435.2023.03.014胡杨A H L 基因家族生物信息学分析及逆境胁迫下
的表达特征
刘行行，种培芳*
(甘肃农业大学林学院，甘肃兰州730070
)
收稿日期:2022-10-08；修回日期:2022-11-28
基金项目：国家自然基金，荒漠植物红砂根际促生细菌筛选及其调控红砂抗逆性的研究(32160407)
；甘肃农业大学青年导师扶持基金，红砂响应盐胁迫的生理特性及耐盐分子机理的研究(G A U -Q D F C -2021-10)；优秀研究生 创新之星 项目(2021C X Z X -397)
；对发展中国家常规性科技援助项目(K Y 202002011
)；红砂㊁白刺抗旱优良种质繁育技术示范与推广，中央财政林业科技推广示范资金(2020Z Y T G 15)资助作者简介：刘行行(1993-)，男，汉族，甘肃天水人，博士研究生，主要从事林木逆境生理生态研究,E -m a i l :583997406@q q
.c o m ;*通信作者A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e ,E -m a i l :z h o n g p
f @
g s a u .e d u .c n 摘要:A T -
h o o k 核定位(A T -h o o km o t
i f n u c l e a r l o c a l i z e d ,A H L )蛋白作为一种小型D N A 结合蛋白，广泛存在于植物中，在植物生长发育㊁逆境胁迫和激素信号应答等方面发挥着重要的作用㊂为全面了解胡杨(P o p u l u s e u p h r a t i c a )A H L 基因家族的结构及功能，利用生物信息学方法及q R T -P C R 对胡杨A H L 家族成员的理化性质㊁基因结构㊁亚细胞定位以及逆境胁迫下的表达特征进行分析㊂理化性质分析表明，胡杨A H L 家族共有19个成员，除P e A H L 16外，其余P e A H L 蛋白均为碱性的不稳定亲水蛋白㊂基因结构分析表明,P e AH L 成员全部为内含子缺失型基因㊂系统进化结果显示，胡杨A H L 家族成员可根据基因类型分为8个亚㊂保守基序分析显示，聚类在同一分支中的P e AH L 基因其m o t i f 组成及排列顺序基本相同㊂在顺式作用元件分析中，响应干旱胁迫的元件其种类和数量最多㊂实时荧光定量分析表明,P e AH L s 的表达受低温㊁高温㊁N a C l 以及P E G 的显著诱导，与对照相比,P e AH L s 在P E G 处理下表达量最高㊂本研究结果为胡杨A H L 基因家族的深入研究提供理论依据，为进一步解析胡杨A H L 基因参与非生物逆境胁迫的分子机制提供参考㊂
关键词:A H L 基因家族；胡杨；生物信息学;q
R T -P C R 中图分类号:Q 344+.13 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2023)03-0741-10
B i o i n f o r m a t i c sA n a l y s i s o f t h eA H LG e n eF a m i l y i n P o p u l u s e u p h r a t i c a a n d i t s E x p
r e s s i o nC h a r a c t e r i s t i c s u n d e r S t r e s s L I U H a n g -h a n g ,C H O N GP e i -f a n g
*
(C o l l e g e o f F o r e s t r y ,G a n s uA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y
,L a n z h o u ,G a n s uP r o v i n c e 730070,C h i n a )A b s t r a c t :A T -h o o km o t i f n u c l e a r l o c a l i z e d (A H L )p r o t e i n ,a s m a l l D N A -b i n d i n gp r o t e i n ,i sw i d e l y
f o u n d i n p l a n t a n d p l a y s a n i m p o r t a n t p a r t i n p l a n t
g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t ,r e s p o n s e s t o a d v e r s i t y s
t r e s s a n dh o r -m o n e s i g n a l i n g .I n o r d e r t o c o m p r e h e n s i v e l y u n d e r s t a n d t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f t h eA H L g e n e f a m i l y
o f P o p u l u s e u p
h r a t i c a ,t h e p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s ,g e n e s t r u c t u r e ,s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o na n de x p r e s -s i o n c h a r a c t e r i s t i c su n d e r s t r e s s o f t h eA H Lf a m
i l y m e m b e r s o f P .e u p h r a t i c a w e r e a n a l y z e db y b i o i n f o r -m a t i c sm e t h o d s a n d q R T -P C R.I tw a s s h o w e db y t h e p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t y a n a l y
s i s t h a t t h e r ew e r e 19m e m b e r s o f t h eA H L f a m i l y ,a n d a l l P e A H L p r o t e i n s a r e b a s i c a n d u n s t a b l e h y d r o p h i l i c p r o t e i n s e x c e p
t f o r P e A H L 16.I tw a ss h o w e db y t h e g e n es t r u c t u r ea n a l y s i s t h a t a l l P e AH L m e m b e r sw e r e i n t r o nd e l e t i o n t y p e g e n e s .I tw a s s h o w e db y t h e p h y l o g e n e t i c t r e e a n a l y s i s t h a t t h em e m b e r s o f t h e P e AH L f a m i l y c o u l d b e s p l i t i n t o8s u b g r o u p sb a s e do n g e n et y p e s .I tw a ss h o w e db y t h ec o n s e r v a t i v e m o t i fa n a l y s i st h a t P e AH L g e n e s c l u s t e r e d i n t h e s a m e b r a n c hh a d e s s e n t i a l l y t h e s a m em o t i f c o m p o s i t i o n a n d a r r a n g
e m e n t o r -d e r .I nt h ea n a l y s i so fc i s -a c t i n g e
l e m e n t s ,t h e m o s td i v e r s ea n da b u n d a n te l e m e n t sw i t h i nt h e P e AH L g e n e sw e r e f o u n do u t i nr e s p o n s e t od r o u g h t s t r e s s .I tw a s s h o w e db y t
h e q u a n t i t a t i v e r e a l -t i m e f l u o r e s -c e n c e a n a l y s i s t h a t t h e e x p r e s s i o no f P e AH L s w a s s i g n i f i c a n t l y i n d u c e db y l o wt e m p e r a t u r e ,h i g h t e m p
e r a -t u r e ,N a C l a sw e l l a s P E G ,a n d t h e e x p r e s s i o n o
f P e AH L s w a s h i
g
h e s t u n d e r P E Gt r e a t m e n t c o m p
a r e dw i t h Copyright ©博看网. All Rights Reserved.
草地学报第31卷t h e c o n t r o l-c h e c k.T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d yp r o v i d e a t h e o r e t i c a l b a s i s f o r t h e i n-d e p t hs t u d y o f t h eA H L g e n e f a m i l y o f P.e u p h r a t i c a a n do f f e r a r e f e r e n c e t o a f u r t h e r a n a l y s i s o n t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f t h e i n v o l v e m e n t o f P e AH L g e n e s i n r e s p o n s e t o a b i o t i c s t r e s s e s.
K e y w o r d s:A H L g e n e f a m i l y;P o p u l u s e u p h r a t i c a;B i o i n f o r m a t i c s;q R T-P C R
A H L蛋白是一种小型的D N A结合蛋白，又称A T-h o o k核定位蛋白(A T-h o o kn u c l e a rl o c a l i z e d p r o t e i n s,A H L)，首次在动物的高迁移率族蛋白(H i g hm o b i l i t yg r o u pp r o t e i n s,HMG)
中发现[1-2]㊂A H L蛋白主要包含两个保守的结构单元,A T-h o o k 基序和植物与原核生物保守结构域(P P C/D U F296, p l a n t s a n d p r o k a r y o t e s c o n s e r v e d)[3]㊂A T-h o o k基序能够与富含A T的B型D N A的小凹槽结合，可以用于构建含有T F肽片段的功能D N A结合物，且所得到的二价嵌合体在亲和力㊁稳定性和选择性方面均显示出优良的D N A识别特性[4-5]，已经在原核生物和真核生物的不同基因家族中被鉴定[6]㊂P P C 结构域长度约为120个氨基酸，主要负责AH L蛋白的核定位[7]㊂在A T-h o o k基序中含有高度保守序列精氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸(R G R P)[8]，并根据其下游氨基酸序列的不同，可划分为A T-h o o k 基序I型和I I型[9]，分别含有保守序列甘氨酸-丝氨酸-赖氨酸-天冬酰胺-赖氨酸(G S K N K)和精氨酸-赖氨酸-酪氨酸(R K Y)㊂在功能上A T-h o o k基序I型已被证明与D N A结合模块具有高亲和力，而A T-h o o k基序I I型则对D N A具有低亲和力[6]㊂同样在P P C结构域中也具有I型和I I型，其分别含有保守序列亮氨酸-精氨酸-丝氨酸-组氨酸(L R S H)和苯丙氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-组氨酸(F T P H)[10]㊂胡杨(P o p u l u se u p h r a t i c a)A H L基因家族可根据A T-h o o k基序和P P C结构域的组成和数量分成三种类型(I型,I I型,I I I型)㊂I型A H L基因由A T-h o o k基序I型(G S K N K)和P P C结构域I型(L R-S H)构成;I I型A H L基因由A T-h o o k基序I型(G S K N K)㊁A T-h o o k基序I I型(R K Y)和P P C结构域I I型(F T P H)构成;I I I型A H L基因由A T-h o o k 基序I I型(R K Y)和P P C结构域I I型(F T P H)构成[11]㊂
A H L蛋白作为转录因子家族的重要一员，在植物生长发育㊁响应逆境胁迫㊁调节植物激素等方面发挥
着至关重要的作用㊂例如拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)中A t AH L01基因定位于染体表面，通过A T-h o o k基序结合到基质结合区(M a t r i xa t-t a c h m e n t r e g i o n s,MA R)上，形成新型的植物MA R 结合蛋白，它通过一个A T-h o o k基序和P P C结构域参与了染质纤维在细胞核中的定位[7]㊂赤霉素(G i b b e r e l l i n s,G A s)是影响植物生长发育的重要激素之一,A t AH L25基因可以有效调控拟南芥中赤霉素A t G A3o x1基因的表达从而影响G A3氧化酶的活性[12]㊂在其他植物中，如长春花(C a t h a r a n-t h u s r o s e u s)AH L s也已被证明参与调节A P2转录因子的茉莉酸反应[13]㊂还有研究表明A t AH L20基因参与了植物先天免疫反应的调节[14]㊂
胡杨属杨柳科(S a l i c a c e a e)杨属，为高大的乔木，成年树木可高达15m~20m，并且在荒漠地区可形成小片的森林[15-16]㊂在中国主要分布于新疆㊁甘肃㊁宁夏㊁青海㊁山西等海拔800m~2400m的荒漠㊁戈壁和河流沿岸地区[17]㊂胡杨不仅喜光㊁耐热㊁耐干旱，适应力强，而且具有抗盐碱㊁抗风沙等优点，在维护生态平衡㊁农畜牧业生产中发挥着重要的作用，素有 大漠英雄树 的美称[18-19]㊂但是随着时间的推移和全球环境不断的变化，胡杨林面积因干旱少雨和人类活动等原因锐减[20]㊂
随着科学技术和研究水平的不断提高，近年来在拟南芥[21]㊁水稻(O r y z a s a t i v a)[8]㊁大豆(G l y c i n e m a x L.M e r r)[22]㊁棉花(G o s s y p i u m)[23]和玉米(Z e am a y s L.)[24]等多种植物中均发现A T-h o o k 蛋白㊂这说明A H L基因家族在陆地植物中高度保守，也暗示了A H L基因家族的生物学重要性㊂2013年胡杨基因组测序的完成为研究胡杨的抗逆分子机制和改善胡杨的抗逆能力提供数据支撑[
25]㊂本实验以胡杨A H L基因家族为研究目标，通过基因结构㊁系统进化㊁亚细胞定位以及q R T-P C R等方法在基因组水平上对胡杨A H L基因家族的理化性质㊁基因结构和基因功能进行预测，探究胡杨A H L 基因家族在生长发育和逆境胁迫等方面所发挥的作用，为今后胡杨的抗逆研究提供理论参考㊂
1材料与方法
1.1试验材料
试验材料选用来自甘肃省酒泉市金塔县的1年生胡杨实生幼苗，移栽并缓苗于人工气候室的光照培养箱中㊂培养温度为24ħ；培养湿度为70%~
247
Copyright©博看网. All Rights Reserved.
第3期刘行行等：胡杨A H L基因家族生物信息学分析及逆境胁迫下的表达特征
80%㊂待缓苗结束后，试验材料经低温(4ħ)㊁高温(42ħ)㊁盐(300m m o l㊃L-1N a C l)和干旱(25% P E G6000)处理于0h,2h,6h和12h时进行叶片取样，用液氮速冻后置于 80ħ冰箱保存备用㊂每个取样点进行三次生物学重复㊂
1.2试验方法
1.2.1胡杨A H L家族成员的鉴定首先从拟南芥数据库(h t t p s://w w w.a r a b i d o p s i s.o r g/)中检索A H L基因的序列信息，然后将拟南芥A H L基因的蛋白序列输入N C B I数据库(h t t p s://w w w.n c b i. n l m.n i h.g o v/)[26]中进行B l a s t比对，出40个胡杨A H L候选蛋白，再根据A H L基因家族所具有的特定结构域，通过P f a m和S MA R T(h t t p://s m a r t.
e m b l-h e i d e l b e r g.d e/)数据库最终鉴定得出19个胡杨A H L蛋白，并且保存19个基因的基因登录号㊁氨基酸数目㊁编码序列(C o d i n g s e q u e n c e,C D S)长度和基因全长等信息㊂再利用E x P a s y网站中P r o t-P a r a mt o o l工具(h t t p s://w e b.e x p a s y.o r g/p r o t-p a r a m/)[27]分析得到P e A H L蛋白的分子量㊁等电点㊁蛋白质总平均亲水性等理化性质㊂
1.2.2胡杨A H L基因家族基因结构㊁保守基序和系统进化树分析使用G S D S2.0(h t t p://g s d s.
c b i.p k u.e
d u.c n/)[28]在线软件分析筛选胡杨AH L 基因家族的基因结构㊂利用M E M E软件(h t t p s:// m
e m e-s u i t e.o r g/m e m e/)[29]在线分析A H L家族成员的保守基序㊂将拟南芥的蛋白序列输入P h y t o-z o m ev12.1数据库中，同源搜索得到毛果杨的A H L基因序列信息，结合胡杨与拟南芥A H L基因
序列使用M E G A7.0以及E v o l v i e w在线软件构建系统进化树，采用最大似然法(M a x i m u ml i k e l i h o o d m e t h o d),B o o t s t r a p值设置为1000㊂
1.2.3胡杨A H L基因家族亚细胞定位和顺式作用元件分析利用W o L FP S O R T(h t t p s://w o l f p-s o r t.h g c.j p/)在线分析胡杨A H L基因家族的亚细胞定位；在胡杨基因组数据库提取P e AH L基因家族成员的启动子序列(起始密码子上游2000b p的核苷酸序列)，利用P l a n t C A R E网站和T B t o o l s软件进行顺式作用元件可视化分析㊂
1.2.4实时荧光定量(q R T-P C R)分析依据胡杨长春分类信息
A H L家族成员所含的顺式作用元件类型，筛选含低温㊁高温㊁N a C l和P E G等逆境胁迫响应相关的元件数量最多的基因，使用P r i m e r3.0软件设计特异性引物(表1)并交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成㊂以U
B Q,A c t i n,E F1α和H I S基因分别作为低温㊁高温㊁N a
C l和干旱的内参基因进行处理分析㊂样品R N A提取采用植物总R N A提取试剂盒(R N e a s y P l a n tM i n iK i t,Q i a g e n),c
D N A合成采用P r i m eS c r i p tR Tr e a g e n tK i t(P e r f e c tR e a l T i m e)试剂盒(T a K a R a)，
并参照说明书进行试验操作㊂q R T-P C R程序为:95ħ30s;95ħ5s,60ħ30s, 95ħ5s;60ħ60s;50ħ30s，共40个循环㊂试验进行3次生物学重复㊂采用2-ΔΔC t法计算基因相对表达量，并使用S P S S26软件对其进行差异显著性分析㊂
2结果与分析
2.1胡杨A H L基因家族理化性质分析
通过P f a m和S M A R T分析软件对40个候选基因的结构域进行对比，最终保留同时含有A T-h o o k基序(R G R P)和P P C/D U F结构域的序列作为胡杨A H L基因家族的成员，命名为P e A H L01-P e A H L19(表2)㊂利用P r o t P a r a mt o o l工具对这19个基因的蛋白序列进行理化性质分析得出:C D S长度在786~1164b p之间，氨基酸长度介于261~387a a㊂P e A H L01的分子质量最小，为26.1k D;P e A H L05的分子量最大，为38.9 k D；理论等电点介于7.07~10.01之间㊂大多数胡杨A H L蛋白不稳定指数大于40；蛋白质总平均亲水性为 0.513~ 0.175㊂
表1引物信息
T a b l e1I n f o r m a t i o no f p r i m e r s
基因名称G e n e n a m e上游引物F o r w a r d p r i m e r(5'-3')下游引物R e v e r s e p r i m e r(5'-3') P
e AH L03G G T A A C A G T G A T A G G A G C G G A A G C G C A C C A A C T G A T G G C A C C T C T A C P e AH L04T A G G T G G T A G T G T G G C T G G T C T T C T G A G G G T T C T A T G T G G T T T G C T G A C P e AH L10G T C A G G C T C G G A A G G T G T T G T T G G A G G C G G T G A T G A T A C T A G G T T T G C P e AH L12T G G G A T T C T T G G G T C T G G G T C T G G T G A G G G C T T G A C A A G G A T C T G A A C P e AH L14G G C T C T T A C C T G C T C G C T A A T G A T G C C A C C A A C T C C T C C A C C A A T A A C A C P e AH L15T G G A C G A G T T G T A G G T G G T G G A G T T G G C T T C T G C T C A T G C T G G T T C
347
Copyright©博看网. All Rights Reserved.
草地学报第31卷表2胡杨A H L基因家族成员基本信息
T a b l e2 B a s i c i n f o r m a t i o no fA H L g e n e f a m i l y m e m b e r s o f P o p u l u s e u p h r a t i c a
基因名称G e n en a m e 基因I D
G e n e I D
C D S长度
L e n g t ho fC D S/b p
基因全长
F u l l l e n g t ho f
g e n o m i c/b p
氨基酸数目
A m i n oa c i d
n u m b e r
分子量
M o l e c u l a r
w e i g h t/D a
等电点
I s o e l e c t r i c
p o i n t
不稳定指数
I n s t a b i l i t y
i n d e x
蛋白质总平均
亲水性
G R A V Y
P e AH L01XM_011036489786145926126052.967.0745.07-0.175 P e AH L02XM_0110316811047193034836388.039.1946.46-0.378 P e AH L03XM_011036106972188032333576.879.1047.86-0.330 P e AH L04XM_011036499114919063823
8306.039.8853.99-0.213 P e AH L05XM_0110202851146178038138921.649.9667.16-0.511 P e AH L06XM_0110298911128185437538386.709.6965.22-0.513 P e AH L07XM_011019194984169132734067.449.0845.05-0.320 P e AH L08XM_0110061741050127334935861.208.9147.13-0.279 P e AH L09XM_0110309541044146834736493.939.4953.34-0.411 P e AH L10XM_0110074081035150934435327.568.9149.08-0.329 P e AH L11XM_0110428591164177538738505.1010.0156.59-0.288 P e AH L12XM_0110244051041254134636238.609.7350.84-0.436 P e AH L13XM_011030958840174727928795.369.8956.87-0.271 P e AH L14XM_0110377331011260333634802.2210.0046.46-0.277 P e AH L15XM_011030802981216932633340.579.5254.28-0.367 P e AH L16XM_011017352987201932834013.469.4336.59-0.208 P e AH L17XM_0110046201065159735436721.729.5447.33-0.485 P e AH L18XM_0110046191098162936537861.009.6847.79-0.498 P e AH L19XM_011035569960149531932675.139.5658.53-0.204
2.2胡杨A H L基因家族基因结构分析
为研究胡杨A H L家族成员的基因结构特性，使用G S D S在线网站对其进行基因结构分析(图1)㊂结果显示,19个P e A H L基因均无内含子，并且在P e A H L 家族成员中P e A H L01的外显子长度最短,P e A H L11最长㊂非编码区最长是P e A H L14，最短为P e A H L08
㊂
图1胡杨A H L基因家族的基因结构分析
F i g.1
G e n e s t r u c t u r e a n a l y s i s o n t h eA
H L g e n e f a m i l y o f P o p u l u s e u p h r a t i c a
2.3胡杨A H L基因家族保守结构域分析
使用ME ME在线软件对胡杨AH L家族成
员进行保守序列分析㊂结果显示，胡杨AH L基
因家族含有11个保守基序(图2A)，长度为7
~50a a,19个P e AHL基因均含有数量不等的
A T-h o o k保守基序和P P C结构域㊂在胡杨
AH L基因家族中除P e AHL01基因只含有2个
保守基序外，其余成员均含有7个以上的基序㊂
其中m o t i f3和m o t i f6是胡杨AH L基因家族的
A T-h o o k保守基序，且m o t i f6为A T-h o o k基序
I型,m o t i f3为A T-h o o k基序I I型㊂m o t i f4则
为P P C结构域㊂
从序列比对中可以看到(图2B)，除P e AH L01
基因含有P P C结构域I型(L R S H)外，其他基因均447
Copyright©博看网. All Rights Reserved.
第3期刘行行等：胡杨A H L基因家族生物信息学分析及逆境胁迫下的表达特征
为P P C结构域I I型(F T P H)㊂胡杨A H L基因家族中只有P e AH L01基因为I型A H L基因; P e AH L04,P e AH L05,P e AH L06,P e AH L08, P e AH L09,P e AH L10,P e AH L11,P e AH L12,P e AH L13,P e AH L14,P e AH L16共11个基因为I I 型A H L基因；其他P e AH L02,P e AH L03, P e AH L07,P e AH L15,P e AH L17,P e AH L18, P e AH L19共7个基因为I I I型A H L基因㊂
图2胡杨A H L基因保守结构域分析(A)及多序列比对(B)
F i g.2 A n a l y s i s o n t h e c o n s e r v e dd o m a i no fA H L g e n e o f P o p u l u s e u p h r a t i a(P a n e lA)a n dm u l t i p l e
s e q u e n c e a l i g n m e n t(P a n e l B)
2.4胡杨A H L基因家族的系统进化树分析
为了探究19个胡杨A H L基因家族的进化关系，使用M E G A7.0软件，采用最大似然法，结合检索得到的18个毛果杨A H L基因和29个拟南芥A H L基因的蛋白序列构建系统进化树(图3)㊂结果显示，胡杨A H L家族成员按照A H L基因的类型可分为C l a d e-I,C l a d e-I I和C l a d e-I I I三大分支以及8个亚族;C l a d e-I I包含A2,A3,A4和A5亚族,A6,A7,A8亚族属于C l a d e-I I I,C l a d e-I只包含A1亚族㊂结果显示胡杨㊁毛果杨和拟南芥的A H L 家族成员没有形成单独聚类的进化分支，表明3个物种的A H L基因家族间存在一定程度的同源性，同时A H L基因家族在进化上出现了很大的分化㊂
547
Copyright©博看网. All Rights Reserved.
版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。
发表评论