流行性出血热诊断标准及处理原则GB15996—1995
流行性出血热诊断标准及处理原则GB 15996—1995
前言
国际上将流行性出血热(EHF)与流行性肾病(Nephopathia epidemica，NE)等统称肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syhndrome，HFRS)。HFRS是由布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus)中某些病毒引起和由某些啮齿动物携带传播的一类自然疫原性疾病。在我国流行的是EHF，黑线姬鼠和褐家鼠为其主要宿主动物和传染源，其传播主要通过与宿主动物或其排泄物(尿、粪)/分泌物(唾液)接融。EHF起病急，进展快，病死率高，早期诊断对降低病死率有着特殊的重要意义。
本标准的附录A，附录B，附录C都是标准的附录；
附录D是提示的附录。
本标准由中华人民共和国卫生部提出。
本标准起草单位：中国预防医学科学院病毒学研究所、中国预防医学科学院流行病学和微生物学研究所、西安医科大学第一附属医院。
本标准主要起草人：宋干、杭长寿、陈化新、张成文。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病监督管理办公室负责解释。
1 范围
本标准规定了流行性出血热(EHF)的诊断标准及处理原则。
本标准适用于各级、各类医疗、卫生、保健机构工作人员对EHF病人的诊断、预防和。
2 诊断原则
依据患者的流行病学史、临床表现及实验室检查结果的综合判断进行诊断，确诊须有血清学或病原学检查结果。
3 诊断标准
3.1 流行病学史
发病在EHF疫区及流行季节，或病前两月内有疫区旅居史，或病前两月内有与鼠类或其排泄物(尿、粪)/分泌物(唾液)直接或间接接触史。
3.2 临床表现
3.2.1 早期症状和体征：起病急，发冷，发热(38℃以上)；全身酸痛，乏力，呈衰竭状；头痛，眼眶痛，腰痛(三痛)；面、颈、上胸部充血潮红(三红)，呈酒醉貌；眼睑浮肿、结膜充血，水肿，有点状或片状出血；上腭粘膜呈网状充血，点状出血；腋下皮肤有线状或簇状排列的出血点；束臂试验阳性。
3.2.2 病程经过：典型病例有发热期、低血压期、少尿期、多尿期和恢复期五期经过。前三期可有重叠，并存在有大量五期不全的异型或轻型非典型病例。
3.3 实验室检查
3.3.1 血检查：早期白细胞数低或正常，3～4病日后明显增多，杆状核细胞增多，出现较多的异型淋巴细胞；血小板明显减少。
3.3.2 尿检查：尿蛋白阳性，并迅速加重，伴显微血尿、管型尿。
3.3.3 血清特异性IgM抗体阳性，见附录A。
3.3.4 恢复期血清特异性IgG抗体比急性期有4倍以上增高，见附录A。
3.3.5 从病人血液白细胞或尿沉渣细胞检查到EHF病毒抗原或EHF病毒RNA，见附录D。
3.4 病例分类
3.4.1 疑似病例：具备3.1及3.2.1。
3.4.2 临床诊断病例：疑似病例加3.2.2，3.3.1，3.3.2。
3.4.3 确诊病例：疑似病例或临床诊断病例加3.3.3，3.3.4，3.3.5中的任一项。
4 预防原则
采取以防鼠灭鼠及疫苗预防接种为主的综合性措施，抓好人间和鼠间的疫情监测，及时报告疫情，见附录B。
4.1 防鼠灭鼠
灭鼠应与防鼠紧密结合。搞好环境卫生及卫生整顿，清除鼠类栖息活动的隐蔽场所，开展以药物杀灭为主，居民区及其周围地区为主的灭鼠措施，在流行高峰期半个月前开展一次突击性灭鼠活动。根据疫区不同类型(家鼠型、姬鼠型、混合型)确定灭鼠重点，一般春季重点在居民区灭鼠，秋季重点在居民区周围及野外灭鼠。
4.2 野外作业工地及生活区的预防措施
进入前对施工区及宿营地区进行流行病学特别是疫源地的监测，施工期内做好防鼠灭鼠工作，加强个人防护措施。
4.3 个人防护
避免与鼠类及其排泄物/分泌物接触，以减少受感染的危险；对高发病区人及对其他疫区高危人接种疫苗。
5 原则
抓好“三早一就”(早发现、早休息、早、就近)措施及发热期的，包括抗病毒、预防性(预防低血压、少尿期出现)。通过综合性抢救措施预防/控制低血压休克、肾功能衰竭、大出血(三关)，做好抢救中的护理工作，见附录C。
附录A
(标准的附录)
流行性出血热血清学诊断方法
A1 应用IgM捕获ELISA法检测EHF IgM抗体
A1.1 原理
根据抗原抗体特异性结合的原理，利用抗人μ链多克隆或单克隆抗体捕获待测血清中的IgM，然后加入特异性抗原和酶标特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)，加底物显。显程度与特异性抗体中的IgM抗体含量呈正相关。以待检血清与特异性抗原和阴性(对照)抗原反应()D值的比值，作为判定IgM抗体反应的标准。
A1.2 材料
a)聚苯乙烯塑料板：40孔或96孔板，U型。
b)可变微量加样器：20μL和100μL各一支。
c)抗人IgM(μ链)：鼠抗人IgM(μ链)单克隆抗体或羊抗人IgM(μ链)多克隆抗体。
d)抗原：阳性抗原：细胞培养EHFV灭活抗原或基因工程表达抗原；
阴性抗原：未接种病毒的细胞培养抗原或无外源基因的相应表达系统抗原。
e)抗IgM阴性或阳性对照血清。
f)辣根过氧化物酶－EHF单克隆抗体标记物(HRP－McAb)。
g)包被液：0.1mol pH9.6的碳酸盐缓冲液(Na(下标始)2(下标终)CO(下标始)3(下标终))3.18g，NaHCO(下标始)3(下标终)5.88g，加蒸馏水至1000mL。
h)洗涤液(×10)：0.2mol pH7.4 PBS－T(Na(下标始)2(下标终)HPO(下标始)4(下标终)·12H(下标始)2(下标终)O 51.6g，NaH(下标始)2(下标终)PO(下标始)4(下标终)·2H(下标始)2(下标终)O 8.7g，NaCl 76g，Tween－20 5mL，溶解至1000mL)高压后使用，临用前10倍稀释。
i)稀释液：上述10倍稀释的PBS－T液，含5％牛血清。
j)底物液：临用前取柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH5.0)(柠檬酸10.2g，Na(下标始)2(下标终)HPO(下标始)4(下标终)·12H(下标始)2(下标终)O 36.8g，加水至1000mL)。
k)终止液：2mol/LH(下标始)2(下标终)SO(下标始)4(下标终)。
A1.3 检测步骤
a)用0.1 molpH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗人IgM(μ链)单克隆抗体(或羊抗人IgM(μ链)，包被聚苯乙烯塑料板，每孔100μL，4℃过夜(或37℃2h)。
b)弃去包被液，用洗涤液重复洗3次，甩干。
c)加待检血清：将血清用PBS－T液稀释100倍，分别加入2反应孔，每孔100μL(如需设阳性和阴性血清对照亦同此法处理)，37℃1h。
d)弃去血清，用洗涤液重复洗5次，甩干。西安为什么会爆发出血热
e)加阳性抗原及阴性抗原：将阳性抗原用稀释液稀释至适当工作浓度，加入其中一反应孔100μL；阴性抗原同样稀释，加入另一反应孔，37℃水浴孵育2h或者置4℃过夜(效果更优)。
f)弃去抗原，用洗涤液重复洗5次，甩干。
g)加HRP－MCAb：将HRp－McAb用稀释液稀释至工作浓度，每孔加入100μL37℃1h。
h)弃去标记物，用洗涤液洗5次，甩干。
i)显：每孔加入100μL新鲜配制的底物溶液。放在室温暗处显。
j)当观察到阳性抗原(或血清)对照显黄而阴性抗原(或血清)对照为无后，每孔加入50μL2mol/LH(下标始)2(下标终)SO(下标始)4(下标终)终止反应。
A1.4 结果判断
a)酶标检测仪测定OD值(空白对照调零)，P/N＝2.1判为阳性(P：阳性抗原孔OD值；N：阴性抗原孔OD值)。
b)目测法：与对照孔比较，阳性抗原孔明显呈淡黄，桔黄或深黄，阴性抗原孔基本无。A1.5 意义
IgM抗体阳性表示患者新近感染EHF病毒。本法具有高度敏感性和特异性，特别适用于EHF 早期特异性诊断。
A2 应用间接酶免疫吸附试验(ELISA)检测EHF IgG抗体
A2.1 原理
根据抗原抗体特异性结合的原理，用纯化病毒抗原包被塑料板，与1∶100连续稀释的待检血清中的特异性抗体结合，其中血清IgG部分又与后加入的酶标记的抗人IgG结合，通过酶与底物的作用产生可见的颜反应，根据反应产物的多少，即颜深浅进行抗体的定量测定。
A2.2 材料
a)聚苯乙烯塑料板及可变微量加样器：同A1.2。
b)包被阳性抗原和正常对照抗原：细胞培养EHFV抗原(灭活)或初步纯化的基因工程表达抗原为阳性抗原；未接种EHFV的细胞培养正常抗原或无外源基因的相应表达系统的抗原为对照抗原。将阳性抗原和对照抗原作2倍稀释，包被聚苯乙烯塑料板，4℃过夜。以适当稀释的EHF恢复期血清测定抗原，选其中特异性抗原孔OD值最高，而对照抗原孔OD值低于0.05的抗原稀释度为工作浓度。
c)辣根过氧化物酶标记抗人IgG(HRP-IgG)，按上述方法确定其工作浓度。
d)阳性对照血清(EHF病人恢复期血清)；待检病人血清(急性期和恢复期病人血清)。
e)抗原包被液，洗涤液，血清和结合物稀释液，底物液及终止液均同A1.2。
A2.3 检测步骤
A2.3.1 用0.1mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原，包被聚苯乙烯塑料板，每孔100μL4℃过
夜(或37℃2h)，同时设阳性和阴性抗原各2孔，分别与阳性血清和待检血清反应。
A2.3.2 弃去包被液，用洗涤液重复洗3～5次，甩干。
A2.3.3 将待检血清从1∶100开始作4倍稀释，加入各抗原孔，每孔100μL37℃1h。
A2.3.4 弃去血清，洗涤液反复洗5次，甩干。
A2.3.5 加酶结合物，每孔100μL，37℃1.5h，同A2.3.4法洗6次，甩干。
A2.3.6 每孔加入100μL新鲜配制的底物溶液，放室温暗处显。
A2.3.7 当阳性抗原与阳性血清对照孔显黄，而阴性抗原孔为无(10～20min)后，每孔加入50μL2mol/LH(下标始)2(下标终)SO(下标始)4(下标终)终止反应。
A2.4 结果判断
a)目测法：即与阴性抗原孔相比较，阳性抗原孔明显呈淡黄，桔黄或深黄显反应，判为阳性。
b)酶标检测仪测定OD值(空白对照调零)，P/N值大于2.1，判为阳性(P：阳性抗原孔OD/492值；N：阴性抗原孔OD/492值)。呈阳性反应血清最高稀释度的倒数，即为病人血清IgG抗体滴度。
A2.5 意义
恢复期病人血清比急性期血清IgG抗体滴度高，有4倍以上升高，可确诊感染，单份血清检测一般表明其曾受过出血热病毒感染，但抗体滴度大于等于1∶320时，结合临床表现及流行病学史，亦可确定为新近毒感染。
A3 应用反向被动血凝抑制试验(RPHI)检测EHF总抗体
A3.1 原理
先将绵羊红血球以戊二醛固定，使其表面阴离子化，再经鞣酸或氯化铬(交联剂)处理，使提纯的特异性抗体吸附到醛化红血球表面致敏，此致敏血球与相应的特异性抗原相遇，即发生特异性抗原抗体反应而使血球凝集，称为反向被动凝集(RPHA)。将含特异性抗体的待检血清与已知抗原先混合，使发生特异性抗原抗体反应而将抗原上的结合位点占据，此时加入抗体致敏血球就不能再与已知抗原起反应，因而不产生血凝，此法称为反向被动血凝抑制(RPHI)。反向被动血凝试验是用来检查抗原的，而反向被动血凝抑制试验则是用来检测抗体的。
A3.2 材料
a)微量塑料板：96孔，U型。
b)可调微量加样器。
c)高效价兔抗EHF IgG致敏的绵羊红细胞，每支含3％冻干红细胞1mL，使用前用蒸馏水恢复至1mL，再用稀释液稀释10倍成0.3％。
d)EHFV抗原(液体或冻干)：使用前必须测定血凝素效价并稀释成4个血凝单位使用。
e)稀释液：pH7.2，0.01mol/L PBS，含1％兔血清，用来稀释所有试剂和被检血清。
A3.3 检测步骤
A3.3.1 抗原血凝单位测定：采用96孔U型板，每孔加入25μL稀释液，取抗原25μL作1∶2，1∶4，1∶8，……，1∶256倍比稀释，然后加0.3％致敏红细胞液25μL于微型振荡器上混匀后，放37℃水浴1h，观察结果，以出现十十的抗原稀释度(如1：64)为1个血凝单位，其前2个抗原稀释度(1∶16)为4个血凝单位。
A3.3.2 被检血清稀释及反应：在U型微量反应板，每孔加稀释液25μL，待检血清先作1：10稀释，取25μL加入第一孔作倍比稀释，然后每孔加入4个血凝单位抗原25μL，混匀，放37℃水浴(湿盒)中作用30min，每孔再加入0.3％致敏的红细胞液25μl，同上混匀，再放37℃湿盒中2h，观察结果。
A3.3.3 设EHF病毒抗原(4个血凝单位)及稀释液空白对照，必要时设EHF病人阳性血清及
阴性(正常人)血清对照。
A3.4 结果判断
在所有对照都成立的前提下，以完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度的倒数为血清抑制抗体效价。
A3.5 意义
本法可作血清流行病学调查，疫苗免疫血清抗体检测。单份血清检测到反向被动血凝抑制抗体阳性，表明该个体曾受过EHF病毒感染，一般恢复期抗体水平比急性期有4倍以上抗体增高，方可确定诊断。
A4 用血凝抑制试验(HI)检测EHF血凝抑制抗体
A4.1 原理
许多病毒都有血凝抗原(血凝素)，能选择性地与多种动物红细胞的受体作用，附着其表面，引起红细胞发生凝集反应，称为红细胞凝集现象，简称血凝(HA)。在血凝素中加入特异性抗体可抑制这种血凝反应，叫血凝抑制(HI)，可用于血凝抑制抗体的测定。
EHF病毒的血凝要求条件比较严格，如对提供红细胞的动物种属(鹅或鸽)和反应的pH值等。不同型的病毒的血凝素及相应的血凝抑制抗体有差异，据此可对病人血清进行分型，推测病人由哪种型别病毒感染。
A4.2 材料
a)微量塑料板：96孔，U型。
b)可调微量加样器：20μL和100μL各一支。
c)血凝抗原(血凝素)：
野鼠型血凝抗原用汉滩型病毒制备，血凝滴度为≥1∶64；
家鼠型血凝抗原用汉城型病毒制备，血凝滴度为≥1∶32。
d)稀释液：
pH6.0磷酸盐缓冲液，用于制备新鲜鹅红细胞(60mL)；
pH9.0硼酸－氢氧化钠溶液(含0.5％牛血清白蛋白)，用于稀释血凝抗原和待检血清。
e)参考血清：
汉滩型免疫血清，汉城型免疫血清。
f)鹅红细胞制备：
鹅翅下静脉抽血，注入阿氏液中混匀，用生理盐水洗涤3次，最后1次以2000r/min离心10min，弃上清，用pH6.0磷酸盐缓冲液稀释鹅红细胞为0.3％，4℃冰箱保存备用。
g)待检血清的处理：
取待检血清用生理盐水配成1∶10，用10倍量4℃冷丙酮处理2次，离心弃上清(丙酮)，将沉淀物真空或室温干燥；加入pH9.0硼酸－氢氧化钠溶液，恢复到1：10浓度，4℃冰箱过夜。于上述每管血清中加入0.05mL压积红细胞，混匀后37℃水浴吸附60min(中间摇动数次)，离心取上清，即为1∶10处理血清。
A4.3 检测步骤
a)血凝抗原单位测定：
在96孔U型微量板上，每孔加入25μLpH9.0硼酸－氢氧化钠稀释液，取待测血凝抗原25μL加入第一孔，并从第一孔起作倍比稀释，最后一孔混匀后弃去25μL，然后于每孔补加25μL稀释液，加入50μL0.3％新鲜鹅红细胞，混匀后置37℃水浴60～90min，观察结果。以最高抗原稀释度出现十十为一个血凝单位(如1∶64)。检测抗体(分型)时用4个血凝单位(即1∶16)。
b)血凝抑制试验：
在U型微量板中，每孔加25μLpH9.0硼酸－氢氧化钠稀释液，再于第一和第二孔及第八孔

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