山东隆大生物工程有限公司诉诺维信公司、诺维信（中国）生物技术有限公司侵害发明专利权纠纷民事判决书
天津市高级人民法院
民事判决书
（2012）津高民三终字第41号 上诉人（原审被告）：山东隆大生物工程有限公司
法定代表人：刘顺启，董事长。
委托代理人：李中奎，该公司技术顾问。
委托代理人：宁光，北京市天驰律师事务所律师。
被上诉人（原审原告）：诺维信公司
法定代表人：米凯尔·维尔托夫特，首席律师。
委托代理人：俞建扬，北京市柳沈律师事务所律师。
委托代理人：封新琴，北京市柳沈律师事务所律师。
被上诉人（原审原告）：诺维信（中国）生物技术有限公司
法定代表人：佩德·H·尼尔森，执行副总裁。
委托代理人：李士弟，天津金诺律师事务所律师。
委托代理人：张平元，北京市柳沈律师事务所律师。
原审被告：天津市众鑫发达商贸有限公司
法定代表人：刘文玲，执行董事。
委托代理人：赵翔，北京市中兆律师事务所律师。
上诉人山东隆大生物工程有限公司（以下简称山东隆大公司）因与被上诉人诺维信公司、诺维信（中国）生物技术有限公司（以下简称诺维信中国公司）、原审被告天津市众鑫发达商贸有限公司（以下简称众鑫发达公司）侵害发明专利权纠纷一案，不服中华人民共和国天津市第二中级人民法院（2011）二中民三知初字第81号民事判决，向本院提起上诉。本院依法组成合议庭，公开开庭审理了本案。上诉人山东隆大公司的委托代理人李中奎、宁光，被上诉人诺维信公司的委托代理人俞建扬、封新琴以及诺维信中国公司的委托代理人李士弟、张平元，原审被告众鑫发达公司的委托代理人赵翔到庭参加诉讼。本案现已审理终结。
原审法院查明，1998年11月26日，诺维信公司向中华人民共和国国家知识产权局申请名称为“热稳定的葡糖淀粉酶”的发明专利。2006年6月28日该申请获授权并公告，专利号为
山东简称:ZL98813338.5，最早的优先权日为1997年11月26日。2011年4月12日，诺维信公司将该专利许可给诺维信中国公司使用，许可方式为排他许可，期限至2018年4月11日，许可费为净销售额的25％。后双方对该专利实施许可在国家知识产权局进行了备案。
本案专利权利要求书记载28项权利要求，诺维信公司和诺维信中国公司主张以权利要求1－6、8－10、12－28确定本案专利的保护范围。在原审诉讼过程中，山东隆大公司于2011年7月1日向国家知识产权局专利复审委员会申请本案专利无效，主要理由为三点:1.权利要求8、9和21保护范围不清楚，不符合专利法第二十六条第四款“权利要求书应当以说明书为依据，清楚，简要地限定要求专利保护的范围。”；2.权利要求的有关技术方案公开不充分，权利要求1－28得不到说明书的支持；3.权利要求1－28均不符合专利法第二十二条第三款关于创造性的规定。诺维信公司针对无效宣告请求答辩的同时申请修改权利要求书，修改的权利要求变更为29项。在原审诉讼中，山东隆大公司申请本案中止诉讼，原审法院未予准许。2012年2月9日，国家知识产权局专利复审委员会作出《无效宣告审查决定》认为，诺维信公司的权利要求修改符合《审查指南》的相关规定，因此无效宣告请求审查决定所依据的文本为诺维信公司新提交的权利要求1－29项和专利授权公告的说明书、说明书附图和说明书摘要。在此基础上，宣告权利要求1－9、12，权利要求13和14中引用
12（d）、（e）、（f）的技术方案，权利要求15－25、27－29中引用权利要求1－9、12的技术方案，以及权利要求15－25、27－29中引用权利要求13和14，并由此间接引用权利要求
12（d）、（e）、（f）的技术方案不符合专利法第二十六条第四款和专利法实施细则第二十条第一款“权利要求应当说明发明或者实用新型的技术特征，清楚、简要地表述请求保护的范围。”的规定，因此无效；权利要求10、11和26、权利要求13和14引用权利要求12（a）、（b）的技术方案、权利要求15－25、27－29中引用权利要求10、11的技术方案，以及权利要求15－25、
27－29中引用权利要求13和14，并由此间接引用权利要求12（a）、（b）的技术方案的基础上继续维持该专利有效。专利复审委员会在《无效宣告请求审查决定》第17页认定本案专利修改后的权利要求10、11的技术方案符合专利法第二十六条第四款的规定时，作出如下论述：从属权利要求
10进一步限定所述的酶分离自T.emersonii菌株，权利要求11限定酶分离自
诺维信公司和山东隆大公司均不服该决定，分别向北京市第一中级人民法院提起行政诉讼。山东隆大公司再次申请本案中止诉讼，诺维信公司和诺维信中国公司为此放弃已被国家知识产权局专利复审委员会宣告无效的权利要求，变更在本案中要求保护的专利权利要求为:⑴（修改前的权利要求7、8，修改后的权利要求10）一种具有葡糖淀粉酶活性的与SEQIDNO:7中所示全长序列之间同源的程度至少为99％，并且具有由等电聚焦测定的低于3.5的等电点的分离的酶，所述的酶来源于丝状真菌Talaromyces属，其中丝状真菌是T.emersonii菌株。⑵（修改前的权利要求9，修改后的
权利要求11）⑴的酶，其中丝状真菌是T.emersoniiCBS793.97。⑶（修改前的权利要求11、
12，修改后的权利要求13）一种克隆的DNA序列，所述DNA序列编码表现出葡糖淀粉酶活性的酶，该DNA序列包括:（a）在SEQIDNO:33中所示DNA序列的所述葡糖淀粉酶编码部分；（b）在SEQIDNO:33中第649－2724位中所示的DNA序列或其互补链。其中所述的DNA序列来源于丝状真菌Talaromyces属，其中丝状真菌是T.emersonii菌株。⑷（修改前的权利要求13，修改后的权利要求14）⑶的DNA序列，其中所述丝状真菌是T.emersoniiCBS793.97。⑸（修改前的权利要求14，修改后的权利要求15）一种用于将淀粉或部分水解的淀粉转化为含有葡萄糖的糖浆的方法，所说的方法包括⑴的葡糖淀粉酶或者由⑶的DNA序列编码的葡糖淀粉酶存在下糖化淀粉水解产物的步骤。⑹（修改前
的权利要求17，修改后的权利要求18）一种糖化液化淀粉溶液的方法，所述的方法包括使用⑴的葡糖淀粉酶或者由⑶的DNA序列编码的葡糖淀粉酶的酶促糖化步骤。⑺（修改前的权利要求18，修改后的权利要求19）根据⑴的葡糖淀粉酶或者由⑶的DNA序列编码的葡糖淀粉酶在淀粉转化过程中的用途。⑻（修改前的权利要求22，修改后的权利要求23）根据⑴的葡糖淀粉酶或者由⑶的DNA序列编码的葡糖淀粉酶在用于生产乙醇的方法中的用途。⑼（修改前的权利要求24，修改后的权利要求25）根据⑴的葡糖淀粉酶或者由⑶的DNA序列编码的葡糖淀粉酶在用于生产柠檬酸、抗坏血酸、赖氨酸、谷氨酸的发酵方法中的用途。⑽（修改前的权利要求26，修改后的权利要求27）一种生产⑴的具有葡糖淀粉酶活性的酶的方法，所述的方法包括（a）在适用于所述葡糖淀粉酶生产的条件下，培养包括DNA构建体的黑曲霉或米曲霉的宿主细胞，所述构建体包括⑶的DNA序列；以及（b）回收所述的葡糖淀粉酶。⑾（修改前的权利要求27，修改后的权利要求28）根据⑽的方法，其中所述具有葡糖淀粉酶活性的酶来源于Talaromycesemersonii。
本案专利说明书记载，本发明涉及一种适合于例如淀粉转化（例如由淀粉生产葡萄糖）的热稳定的葡糖淀粉酶。本发明还涉及所说的热稳定葡糖淀粉酶在各种方法中的用途，尤其是在淀粉传统方法中的糖化步骤中的用途。发明背景：葡糖淀粉酶（1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3）是催化由淀粉或有关寡糖和多糖分子的非还原端释放出D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶是由包括黑曲霉和泡盛曲霉在内的几种丝状真菌和酵母生产的。在商业上，将葡糖淀粉酶用于转化已由α-淀粉酶部分水解为葡萄
糖的玉米淀粉。通过葡糖异构酶可以将葡萄糖进一步转化成几乎由等量的葡萄糖和果糖组成的混合物。这种混合物、或者进一步富集了果糖的混合物是在全世界商品化的通常使用的高果糖玉米糖浆。这种糖浆是世界上由酶促方法生产的最大吨位的产品。参与淀粉转化为果糖的三种酶属于所生产的最重要的工业酶之列。就葡糖淀粉酶的商业用途而言，在高果糖玉米糖浆的生产中存在的主要问题之一为葡糖淀粉酶的热稳定性相当差，比如可以通过商业途径得到的黑曲霉的葡糖淀粉酶（即由NovoNordiskA/S销售的AMG）。商用的曲霉素葡糖淀粉不如α-淀粉酶或葡糖异构酶那样具有热稳定性，并且在较低的PH值下它比α-淀粉酶或葡糖异构酶的活性更大和更稳定。因此，必须在更低的温度和PH下在独立的容器中使用它。美国专利4,247,637描述了一种分子量约为31000Da的热稳定葡糖淀粉酶，它来源于Talaromycesduponti并适合于将液化的淀粉溶液糖化为糖浆。当在70℃、PH4.5下保持10分钟时，指出该葡糖淀粉酶保留了其最初葡糖淀粉酶活性的至少约90%。美国专利4,587,215公开了一种来源于嗜热踝节菌的种的分子量约为45000Da的热稳定淀粉葡糖苷酶。这种公开的淀粉葡糖苷酶（或葡糖淀粉酶）在两个不同的阶段丧失了其酶活性，即迅速衰减的最初阶段、接下来是缓慢衰减的阶段。在70℃（PH=5.0）下，迅速衰减的半衰期约为
18分钟，而在衰减的第二阶段在1小时内没有测量到活性的丧失。BunniL等人（1989）《酶微生物学技术》第11卷第370-375页涉及由TalaromycesemersoniiCBS814.70生产的至少一种形式的α-
淀粉酶和一种形式的α-葡糖苷酶组成的胞外淀粉分解系统的生产、分离和部分鉴定。只分离、纯化和
鉴定了α-淀粉酶。本发明基于发现了一种适用于例如淀粉转化过程中的糖化步骤的新的热稳定葡糖淀粉酶。术语“葡糖淀粉酶”和“AMG”在以下是可互换使用的。采用以下“材料与方法”部分中所述的方法，以T1/2（半衰期）测量本发明葡糖淀粉酶的热稳定性。本发明的发明人已经从Talaromycesemersonii的一个菌株中分离、纯化并鉴定了一种热稳定葡糖淀粉酶，该菌株目前以编号CBS793.97保藏在真菌菌种保藏中心。当应用于蛋白质时，术语“分离的”是指在并非其天然环境的条件下发现蛋白质。在一个优选的形式中，分离的蛋白质基本上不含其它的蛋白质，特别是不含其它同源蛋白质（即“同源杂质”）。优选提供呈大于40%纯度形式的蛋白质，更优选呈大于60%纯度形式的蛋白质。甚至更优选的是优选提供呈高度纯化形式的蛋白质，即纯度大于80%、更优选纯度大于95%并且甚至更优选纯度大于99%，其中纯度是由SDS-PAGE测定的。另外，术语“分离的酶”也可以称作“纯化的酶”。术语“同源杂质”意指起源于同源细胞的任何杂质（例如，不是本发明多肽的另一种多肽），其中本发明的多肽最初是从所述同源细胞中获得的。与诸如黑曲霉葡糖淀粉酶（可以从NovoNordiskA/S以商品名AMG购得）之类的现有技术中的葡糖淀粉酶相比，分离的葡糖淀粉酶具有非常高的热稳定性。正如以下实施例12中所述的那样，测定在酵母中表达的重组T.emersoniiAMG的T1/2约为110分钟。因此，在第一方面，本发明涉及一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的酶，该酶在50MmNaOAc,0.2AGU/ml,Ph4.5,70℃下具有至少100分钟的
T1/2（半衰期）。在第二方面，本发明涉及一种具有葡糖淀粉酶活性的包括SEQIDNos.1-6所示的一个
或多个部分序列的酶，或SEQIDNO:7中所示全长的酶，或者一种具有葡糖淀粉酶活性的与其基本同源的酶。术语“部分序列”是指在较长的多肽序列中包含的部分多肽序列，其中所说的较长的多肽序列具有感兴趣的活性。本发明还涉及编码本发明葡糖淀粉酶的克隆的DNA序列。而且，本发明还涉及一种转化淀粉或者部分水解淀粉成含有例如葡萄糖的糖浆的方法，所说的方法包括在本发明葡糖淀粉酶存在下糖化淀粉水解产物的步骤。本发明的一个目的在于提供一种使液化淀粉溶液糖化的方法，其中酶促糖化作用是采用本发明的葡糖淀粉酶来实现的。此外，本发明涉及本发明的葡糖淀粉酶在淀粉转化过程，如在连续淀粉转化过程中的用途。在连续淀粉转化过程的一个实施方案中，它包括连续的糖化步骤。本发明的葡糖淀粉酶也可以用于生产寡糖或特制糖浆的方法中。最后，本发明涉及微生物TalaromycesemersoniiCBS793.97或其能够生产本发明葡糖淀粉酶的突变体的分离的纯培养物。
专利说明书第8页“淀粉的转化”项下记载，本发明提供了一种采用本发明的热稳定葡糖淀粉酶由淀粉生产葡萄糖等的方法。一般来说，该方法包括以下步骤：在α—淀粉酶存在下部分水解前体淀粉，然后在葡糖淀粉酶的存在下通过断裂开α—（1→4）和α—（1→6）糖苷键进一步由淀粉或有关寡糖和多糖分子的非还原端水解释放出D－葡萄糖。利用α—淀粉酶部分水解前体淀粉通过水解内部α—（1→4）键提供了对淀粉分子的初步破坏。在商业应用中，在大约105℃温度下进行采用α—淀粉酶的初步水解。加工浓度非常高的淀粉，通常为30％至40％的固体。在这一升高的温度下，通常初步水解5分钟。然后，可以把部分水解的淀粉转移到第二个罐中，并且在85℃至90℃的温度下培养约1小时，以便产生10至15当量的葡萄糖（D.E）。一般在独立的罐中在介于30℃与
60℃之间降低的温度下进行在葡糖淀粉酶存在下由淀粉或有关寡糖和多糖分子的非还原端进一步水解释放D－葡萄糖的步骤。优选地，将底物液体的温度降至55℃与60℃之间。把溶液的PH值由6至6.5降低到3与3.5之间。优选地，溶液的PH为4至4.5，将葡糖淀粉酶加入溶液中并且反应24－72小时、优选36－48小时。通过使用本发明的热稳定葡糖淀粉酶，可以在比传统分批糖化步骤更高的温
度下进行糖化步骤。根据本发明，可以在60℃－80℃以上的温度范围内进行糖化，其中优选
63－75℃。这既适用于传统的分批过程（上述），又适用于连续的糖化过程。实际上，必须在60℃以上的温度进行包括一个或多个膜分离步骤（即过滤步骤）的连续糖化过程，以便能够维持相当高的垮膜通量。因此，本发明的热稳定葡糖淀粉酶在工业糖化过程可接受的时间段内以合理的价格提供了进行大规模连续糖化过程的可能性。根据本发明，甚至可以缩短糖化时间。通常，本发明葡糖淀粉酶的活性在60℃－80℃的温度下基本上要高于在传统采用的30℃－60℃温度下的酶活性。因此，通过升高葡糖淀粉酶工作的温度，可以在较短的时间段内完成糖化过程，或者可以采用剂量更少的酶来完成该过程。由于例如与可以通过商业途径得到的黑曲霉葡糖淀粉酶（即AMG）相比，本发明葡糖淀粉酶的热稳定性是非常高的，因此在糖化过程中需要加入更少量的葡糖淀粉酶以替换掉正被灭活的葡糖淀粉酶。根据本发明，在糖化过程中更多的葡糖淀粉酶保持为有活性的。此外，当在63℃以上的温度进行糖化过程时，也减少了微生物污染的危险。通过使用比活性（以针对麦芽糖的活性进行测量）增加了的葡糖淀粉酶，在糖化过程中可能需要更少剂量的酶。其中可以有利地使用本发明葡糖淀粉酶的糖
化过程的例子，包括JP3-224493；JP-191693；JP62-
272987；和EP452238中所述的过程。另一方面，本发明涉及一种糖化液化淀粉溶液的方法，该方法包括采用本发明葡糖淀粉酶的酶促糖化步骤。在本发明的方法中，可以与仅仅水解含有至少4个葡糖残基的分子中α—（1→6）糖苷键的酶结合使用本发明的葡糖淀粉酶。优选地，与支链淀粉酶或异淀粉酶结合使用本发明的葡糖淀粉酶。在G.M.A.vanBeynum等人的《淀粉转化技术》（MarcelDekker，纽约，1985，101-142）中列举了用于脱支的异淀粉酶和支链淀粉酶的用途
，所述酶的分子性质以及结合葡糖淀粉酶的所述酶潜在的用途。另一方面，本发明涉及本发明的葡糖淀粉酶在淀粉转化过程中的用途。此外，可以在包括连续糖化步骤在内的连续淀粉转化过程中使用本发明的葡糖淀粉酶。也可以以固定化的形式使用本发明的葡糖淀粉酶。这适合于并且经常用于生产特制糖浆（如麦芽糖糖浆），并且进一步与果糖糖浆的生产相结合用来产生寡糖的残液流。也可以在生产用于燃料或饮料的乙醇的方法中使用本发明的葡糖淀粉酶，或者可以在用于生产有机化合物（诸如柠檬酸、抗坏血酸、赖氨酸、谷氨酸）的发酵方法中使用所述的酶。
专利说明书第30－31页记载了SEQIDNO:7的信息，序列特征：长度为591个氨基酸；类型为氨基酸；链形为单链；拓扑结构为线形；分子类型：蛋白质；最初来源：菌株为TalaromycesemersoniiCBS793.97；序列描述
:
AlaThrGlySerLeuAspSerPheLeuAlaThrGluThrProIleAlaLeuGlnGlyValLeuAsnAsnIleGlyProAsn GlyAlaAspValAlaGlyAlaSerAlaGlyIleValValAlaSerProAsnGlyAlaAspProAsnTyrPheTyrSerTrpTh rArgAspAlaAlaLerThrAlaLysTyrLerValAspAlaPheAsnArgGlyAsnLysAspLeuGluGlnThrIleGlnGln TyrRleSerAlaGlnAlaLysValGlnThrIleSerAsnProSerGlyAspLeuSerThrGlyGlyLeuGlyGluProLysPh eAsnValAsnGluThrAlaPheThrGlyProTrpGlyArgProGlnArgAspGlyProAlaLeuArgAlaThrAlaLeuIl eAlaTyrAlaAsnTyrLeuIleAspAsnGlyGluAlaSerThrAlaAspGluIleIleTrpProIleValGlnAsnAspLeuS erTyrIleThrGlnTyrTrpAsnSerSerThrPheAspLeuTrpGluGluValGluGlySerSerPhePheThrThrAlaVa lGlnHisArgAlaLeuValGluGlyAsnAlaLeuAlaThrArgLeuAsnHisThrCysSerAsnCysValSerGlnAlaPr oGlnValLeuCysPheLeuGlnSerThrTrpThrGlySerTyrValLeuAlaAsnPheGlyGlySerGlyArgSerGlyLy sAspValAsnSerIleLeuGlySerIleHisThrpheaspproalaglyglycysaspaspserthrpheglnprocysSerAl aArhAlaLeuAlaAsnHisLysValValThrAspSerPheArgSeriletyralaileasnserglyilealagluglyseralaval alaValglyargtyrprogluaspvaltyrglnglyglyasnprotrptyrLeualathralaalaalaalagluglnleutyraspal
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