贵州省刺梨中抗坏血酸含量HPLC测定方法优化
质量控制Quality Control
中国果菜
China Fruit&Vegetable第41卷，第6期
2021年6月
贵州省刺梨中抗坏血酸含量
HPLC测定方法优化
钱志瑶1,2，龚艳丽2，梁芳瑜3，罗忠圣4，徐昌艳3，覃容贵3*
刺梨汁（1.贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵州贵阳550025；2.贵州医科大学公共卫生与健康学院，
贵州贵阳550025；3.贵州医科大学药学院，贵州贵阳550025；4.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州
贵阳550014）
摘要：贵州省蕴藏着较丰富的刺梨资源，抗坏血酸是刺梨中主要的活性成分之一。为探究较优高效液相谱法
（HPLC）对贵州省刺梨中抗坏血酸进行含量测定，试验分别对流动相、柱温、流速进行方法优化，确定适用的谱条件，
并进行方法学考察。采用所优化的方法对贵州省刺梨中抗坏血酸进行含量测定，测定结果与食品安全国家标准“食品
中抗坏血酸的测定”中第一法HPLC测定所得结果使用配对样本T检验比较两者是否存在差异。结果表明，以流动相
为0.05%草酸水溶液与甲醇（98∶2），柱温为25℃，流速为0.7mL/min，检测波长为245nm，进样量20μL时，所得测
定方法耐用性、专属性、精密度、稳定性、重复性、回收率均较好，刺梨中抗坏血酸含量在0～50μg/mL范围内线性关系
良好（2=0.9999）。同时，刺梨中抗坏血酸含量与国标方法所测抗坏血酸含量差异无统计学意义（＞0.05）。因此，优化所得HPLC法检测贵州省刺梨中抗坏血酸含量结果准确、可靠，操作简便，适用于
贵州省刺梨中抗坏血酸的含量测定。
关键词：刺梨；高效液相谱法；抗坏血酸；含量测定
中图分类号：R151.3文献标志码：A文章编号：1008-1038(2021)06-0120-06
DOI：10.19590/jki.1008-1038.2021.06.021
Optimization of HPLC Method for Determination of Ascorbic Acid
in from Guizhou Province
QIAN Zhi-yao1,2,GONG Yan-li2,LIANG Fang-yu3,LUO Zhong-sheng4,XUN Chang-yan3,QIN Rong-gui3*
(1.The Key Laboratory of Environmental Pollution Monitoring and Disease Control,Guiyang550025,China;
2.School of Public Health,Guiyang550025,China;
3.Pharmacy School,Guizhou Medical University,
Guiyang550025,China;4.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of
GuizhouProvince and Chinese Academy of Sciences,Guiyang550014,China) Abstract:There are abundant resources of in Guizhou province,and ascorbic acid is one of the main
收稿日期:2021-06-06
基金项目：贵州省科技厅科技支撑项目（黔科合支撑[2020]1Y148号）
第一作者简介：钱志瑶（1990—），女，实验师，硕士，主要从事天然产物功效物质研究工作
*通信作者简介：覃容贵（1970—），女，教授，博士，主要从事中药资源与质量评价研究工作
刺梨（Tratt.Ros.Monogr.）属蔷薇科蔷薇属植物，为多年生落叶丛生灌木，主要分布于我国贵州、云南、四川、湖南等地区，尤其以贵州省品种最多、年产量最高[1]，刺梨的营养价值较高，主要含有抗坏血酸、优质膳食纤维[2]、多糖、黄酮、超氧化物歧化酶（SOD）、刺梨甾醇（-谷甾醇）及三萜类化合物等成分，具有促进胃肠道消化[3]、调节人体免疫功能、延缓衰老、抑制癌细胞增殖、抗氧化[4]、抗动脉粥样硬化、降低人体胆固醇、防治糖尿病[5-6]、辐射防护与抗凋亡等药理作用[7-8]。
抗坏血酸又名维生素C，是植物和大多数动物体内合成的一类已糖内酯化合物，也是人体必需的一种
物质，用来维持人体的正常生长发育，具有清除自由基、抗衰老、抗氧化、调节人体机能等功效[10]，由于人体内缺乏其合成的关键酶导致无法合成抗坏血酸，因此人体内抗坏血酸的获取主要来源于富含抗坏血酸的蔬菜及水果等植物[11]。
试验为探究简便快捷、测定结果准确、用于测定贵州省刺梨中抗坏血酸含量的HPLC测定法，以GB 5009.86—2016食品安全国家标准“食品中抗坏血酸的测定”[12]中第一法高效液相谱法的谱条件为基础，分别对流动相、柱温、流速进行优化，确定最佳的谱条件，并对贵州省刺梨中抗坏血酸进行含量测定，将测定的抗坏血酸含量与GB5009.86—2016食品安全国家标准“食品中抗坏血酸的测定”[12]中第一法高效液相谱法测定的结果进行比较，确定所优化方法的可行性，为贵州省刺梨中抗坏血酸的含量测定，刺梨功能性食品、膳食补充剂和药物制剂的质量评价提供更多的检测方法。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试剂
维生素C标准品，贵州迪大科技有限责任公司；草酸，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；偏磷酸、磷酸二氢钾，国药集团化学试剂有限公司；甲醇，谱纯，默克股份两合公司；刺梨，贵州省刺梨鲜果，来源见表1。
表1贵州省刺梨来源
Table1Sources of in Guizhou province
active components in.The aim of study was to determine the content of ascorbic acid in from Guizhou province by HPLC.The mobile phase,column temperature and flow rate were optimized to determine the suitable chromatographic conditions,and the methodology was investigated.At the same time,the optimized method was used to determine the content of ascorbic acid in from Guizhou Province,and the results were compared with those of the first HPLC method in the national food safety standard"determination of ascorbic acid in food"by paired sample t-test.The results show that,when the mobile phase was0.05%oxalic acid aqueous solution and methanol(98∶2),the column temperature was25℃,the flow rate was0.7mL/min,the detection wavelength was245nm,and the sample volume was20μL,the obtained method had good durability,specificity,precision, stability,repeatability and recovery,and the linear range of ascorbic acid content in was0-50μg/mL (2=0.9999).There was no significant difference in ascorbic acid content between the optimized method and the national standard method(＞0.05).Therefore,the optimized HPLC method was accurate,reliable,simple and suitable for the determination of ascorbic acid in from Guizhou province.
Keywords:;high performance liquid chromatography;ascorbic acid;content determination
编号来源
S1大方县对江镇安兴村
S2松桃县公园路与丹霞路交叉路口
S3遵义市汇川区田泽镇九龙村
S4遵义市播州区三合镇上凉村
S5贵阳市白云区沙文镇白金大道汉方药业
S6印江县沙子坡镇青球村桂下组
S7贵州省麻江县杏山镇
S8贵阳市乌当区永乐镇
S9德江县上堰村罗家村民组
S10贵阳市乌当区大转湾
S11雷山县丹江镇羊场坝
质量控制钱志瑶，等：贵州省刺梨中抗坏血酸含量HPLC测定方法优化121
1.1.2仪器与设备
高效液相谱仪，Agilent HPLC1100型，美国Agilent 公司；谱柱，ACE Excel5C18-AR250mm×4.6mm，5μm、资生堂C184.6mm×250mm，5μm、XSelectR CSH TM C184.6mm×250mm，5μm；高功率数控超声波清洗器，KQ-800KDV型，昆山市超声仪器有限公司；电子天平，XSE105DU型，METTLER TOLEDO；0.45μm有机滤膜，江苏绿盟科学仪器有限公司。
1.2方法
1.2.1样品前处理
取贵州省刺梨鲜果榨汁，加水使每毫升刺梨汁中含1g刺梨鲜果，过滤，得刺梨汁。
1.2.2对照品溶液的制备
精密称取VC标准品适量，0.05%草酸溶液稀释并定容至浓度为0.01mg/mL，混匀，即得对照品溶液。
1.2.3样品溶液的制备
称取刺梨汁约0.5g，0.05%草酸溶液稀释并定容至100mL，混匀，吸取1mL样品稀释液于10mL容量瓶中，0.05%草酸溶液定容，混匀，即得浓度为0.5mg/mL样品溶液。
1.2.4谱条件
（1）流动相选择
分别以0.01%、0.05%、0.10%浓度草酸溶液为水相，100%甲醇为有机相，按水相∶有机相=98∶2比例，取对照品溶液、样品溶液进样检测，选择最佳流动相水相。（2）流速选择
取对照品溶液、样品溶液，分别用流速0.4、0.7、1.0、1.3mL/min进样检测。
（3）柱温选择
取对照品溶液、样品溶液，分别用柱温25、30、35℃进样检测。
1.2.5方法学考察
（1）耐用性试验
取对照品溶液、样品溶液，分别使用ACE Excel5 C18-AR、资生堂C18、XSelectR CSH TM C18谱柱，进样检测。
（2）专属性试验
分别取对照品溶液、样品溶液进样检测，按照式（1）计算抗坏血酸理论塔板数，同时根据所得谱图对刺梨
中抗坏血酸谱峰的分离情况、峰形以及有无干扰峰进行判断。
抗坏血酸理论塔板数=5.54×（保留时间
半高峰宽
）2（1）（3）线性关系
分别取浓度0.1mg/mL的VC对照品溶液0、0.05、0.5、1.0、2.5、5mL，0.05%草酸稀释并定容至10mL，即得标准曲线工作液浓度分别为0、0.5、5.0、10、25、50μg/mL。将其逐次进样检测，以VC对照品溶液浓度（μg/mL）为横坐标，相对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。（4）精密度试验
取同一对照品溶液于高效液相谱仪中连续进样6次，得谱峰面积，求其平均值、。
（5）稳定性试验
取同一样品溶液于0、1、2、3h后分别在高效液相谱仪中进样检测，得谱峰面积，求其平均值、。（6）重复性试验
按照1.2.3方法平行配制6份样品溶液，于高效液相谱仪中进行检测，得谱峰面积，求其平均值、。（7）回收率试验
称取0.25g刺梨汁于100mL容量瓶中9份，分别加入经计算后已知样品中VC含量的80%、100%、120%的VC对照品溶液（各平行三份），0.05%草酸溶液定容，从中吸取1mL溶液，置于10mL容量瓶中，0.05%草酸溶液稀释定容，混匀，于高效液相谱仪中检测。根据样品中原有抗坏血酸含量、抗坏血酸加入量、样品测得抗坏血酸量，计算抗坏血酸的回收率、。
1.2.6刺梨中抗坏血酸的含量测定
取1g/mL刺梨汁按1.2.3方法进行配制，使用本试验优化的方法测定各刺梨样品中抗坏血酸含量。同时使用GB5009.86—2016食品安全国家标准“食品中抗坏血酸的测定”[11]中第一法高效液相谱法测定贵州省刺梨抗坏血酸含量。使用IBM SPSS Statistics26软件进行数据统计，采用配对样本T检验对两种方法测定的刺梨中抗坏血酸含量进行比较，判断所测结果是否具有差异。
抗坏血酸含量的计算参考文献[13]的方法，根据公式（3）（4）计算回收率。
/（mg/g
（3）式中，-样品中抗坏血酸的含量，mg/g；样-各样
质量控制
中国果菜122
品抗坏血酸浓度，μg/mL；0-样品定容的体积，mL；-称样量，g。
回收率/%=
测得抗坏血酸含量－样品中原有抗坏血酸含量
加入抗坏血酸含量
×100（4）2结果与分析
2.1谱条件的确定
通过对谱条件进行优化，试验结果比较分析得，流动相以0.05%草酸-甲醇（98∶2）的配比时，刺梨中抗坏血酸的谱峰峰形对称性较好（图1）。柱温的改变对于刺梨中抗坏血酸谱峰的出峰时间和峰型没有明显变化，实验室的室温接近25℃，故选择柱温为25℃（图2）。流速过快，出峰的时间较早，与溶剂干扰峰比较接近，流速过慢，出峰时间过晚，影响实验效率，故确定流速为0.7mL/min（图3）。本试验的谱条件为流动相：0.05%草酸-甲醇（98∶2）；柱温：25℃；流速：0.7mL/min。
图1不同流动相水相浓度样品谱图
Fig.1Chromatogram of water concentration in different
mobile phases
2.2耐用性试验
本试验所优化的刺梨抗坏血酸的测定方法在谱柱型号发生改变后，测定出的峰面积没有受到明显的影响，表明试验优化的抗坏血酸检测方法对可变试验因素的抗干扰能力较强。
图2不同流速样品谱图
Fig.2Chromatogram of samples with different flow rates
图3不同柱温样品谱图
Fig.3Chromatogram of samples with different column
temperatures
2.3专属性试验
对照品溶液、供试品溶液的高效液相谱中抗坏血酸理论塔板数（）分别是24002.7、22208.6，供试品溶液中抗坏血酸谱峰分离较好，峰形对称，并且阴性无干扰，如图4、5（见下页）。该方法专属性良好。
2.4标准曲线及线性方程
刺梨抗坏血酸在0～50μg/mL范围内线性良好，回归方程：=96.094-2.958，相关系数2=0.9999。
项目谱柱保留时间/min峰面积/mAU对称性平均峰面积
对照品
ACE Excel5C18  5.729949.80.829
946.5  1.198资生堂C18  6.284965.30.841
XSelectR CSH TM C18  5.797943.20.746
样品
ACE Excel5C18  5.737625.00.844
622.55  1.063资生堂C18  6.421611.90.867
XSelectR CSH TM C18  5.796620.10.747
表2耐用性试验结果
Table2Durability test
results
质量控制钱志瑶，等：贵州省刺梨中抗坏血酸含量HPLC测定方法优化123
项目保留时间/min
半高峰宽对照品  6.4210.0975524002.7样品
6.284
0.09925
22208.6
表3
对照品尧供试品溶液抗坏血酸理论塔板数
Table 3Theoretical plate number of ascorbic acid solution
of reference substance and test substance
图4对照品HPLC 谱图
Fig.4HPLC chromatogram of reference substance
图5样品HPLC 谱图
Fig.5HPLC chromatogram of the sample
2.5精密度试验
测得对照品中抗坏血酸平均峰面积为960.28，为0.406%，表明该方法测定结果的精密度良好。
2.6稳定性试验
测得供试品溶液中抗坏血酸平均峰面积为605.95，为1.001%，表明供试品溶液在3h 内测定基本稳
定。
2.7重复性试验
测得供试品溶液中抗坏血酸平均峰面积为
1217.97，
为0.486%，表明该方法重现性好。
2.8回收率试验
回收率试验中，抗坏血酸添加量为已知样品中抗坏
血酸含量的80%，平均回收率为101.38%，为
0.64%；添加量为已知样品含量的100%，平均回收率为
99.44%，
为0.53%；添加量为已知样品含量的120%，
平均回收率为99.06%，
值为0.21%。回收率较好。
2.9两种方法测定贵州省刺梨中抗坏血酸含量结果比较
使用IBM SPSS Statistics 26软件进行数据统计，配对样本T 检验分析，＞0.05，按
=0.05水准，差异无统计
学意义，可认为试验优化的测定方法刺梨中抗坏血酸的含量与GB 5009.86—2016食品安全国家标准
“食品中抗坏血酸的测定”中第一法HPLC 测定刺梨中抗坏血酸含量两者无明显差异（表4）。
表4
两种方法测定刺梨中抗坏血酸含量结果比较
Table 4Comparison of ascorbic acid content in roxburgh
determined by two methods
注：抗坏血酸含量①为试验优化的HPLC 法检测出的刺梨抗坏血酸含量，单位mg/g ；抗坏血酸含量②为GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》中第一法HPLC 检测出的刺梨抗坏血酸含量，
单位mg/g 。3讨论
GB 5009.86—2016食品安全国家标准“食品中抗坏血酸的测定”中记载了3种检测抗坏血酸含量的方法，分别为高效液相谱法、荧光法、2,6-二氯靛酚滴定法[12]。荧光法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定，但大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，需进行前处理，操作步骤复杂，试剂和样品溶液稳定性差，且某些果胶含量高的样品不易处理。操作过程中使用的活性炭，虽然可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但其有吸附抗坏血酸的作用，影响抗坏血酸含量的测定，且由于影响荧光强度的因素较多，大批量检测时，测定条件很难完全再现，易造成检测结果的不准确性[
13-14]。2,6-二样品编号抗坏血酸含量①
抗坏血酸含量②
值
S1
10.75710.4910.056S2  6.867  6.865S313.38013.852S47.3597.379S510.59310.751S6  4.409  4.210S715.53214.895S8  5.490  3.381S914.4028.868S10  5.019  3.102S11
7.173
3.922
质量控制
中国果菜
124

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。