STR常见问题、原因及解决方法讨论整理
stutter产物
1、什么是stutter产物?
stutter产物又被称为影子带，或者DNA聚合酶滑脱产物。（复制链错配假说）PCR产物比主要扩增产物少一个重复单位。
2、产生机制
DNA复制过程中的滑动，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个
重复单位的缺失或插入造成。
DNA复制过程中，因为子带链的插入或模板链的脱落导致的引物一模板复合物的一个区域在引物延伸的过程中发生错配，此时引物或者模板滑脱导致一个重复单位形成碱基非配对环。
（a）在复制过程中重复区域DNA双链很容易彼此解开。由于每个重复单位相同，在双链重
新复性时可能会不按照配对顺序，从而发生一个重复单位的错位。（b）如果在延伸过程中新合成链凸出一个重复单位，则会在下一轮复制过程中增加一个重复单位形成插入。（c）反过来讲，如果在模板链凸出一个重复单位，则新合成的链就比全长STR等位基因短一个重复单位。这种情况发生的频率与侧翼序列、重复单位及待扩增等位基因的长度有关。总的来说，四核苷酸STR基因座stutter产物出现频率小于15％，在分型图谱中表现为一个比STR等位基因短一个重复单位的小峰。
3、表现状态
1、通常比相应的主要等位基因小一个重复单位，或多一个重复单位
2、一般小于相应等位基因峰高的15%。
3、stutter 的量取决于基因座、PCR条件以及所用的聚合酶。
4、随重复单位的增长stutter产物有减少的倾向。
（五核苷酸重复＜四核苷酸重复＜三核苷酸重复＜二核苷酸重复）
5、在一个基因座内较大等位基因的stutter产物量更多。
6、序列重复不完全时，stutter产物量减少。（详细翻阅法医DNA分型第六章）
减少stutter产物的方法：
1、应用重复单位较长的STR标记（四、五碱基重复）；
2、含有不完全重复单位的STR等位基因（TH01 9.3）；
3、选用扩增活性强的DNA聚合酶（如C-Taq酶）；
4、优化扩增条件。
补充：为什么一个基因座Pannel下出现3个扩增峰？
1样本本身即为三带
② 其他荧光引起的ol是什么单位Pull-up峰
③ 两个等位基因的Stutter峰恰好重叠，导致Stutter峰叠加偏高
二、非模板添加（+A不全或-A峰）
1、 产生机制
DNA聚合酶在复制模板链时在PCR产物的3`末端添加一个额外的腺苷酸（+A），故PCR产物比实际靶序列长一个碱基，而当酶在DNA复制过程中没有在所有复制链上添加腺苷酸，则产生-A峰。
2、表现状态
3、解决方法
1）在非标记引物5’端添加特殊“尾巴” ( e.g., G or GTTCTT )详细翻阅法医DNA分型第六章
2）提高终延伸温度（1℃左右）或增加终延伸时间(e.g., 15-45 min at 60 or 72 ℃)
3）调整模板DNA浓度至最适宜范围(e.g., 0.5～2.0ng)，一般为降低模板浓度
4）换用高质量的Taq酶(e.g., AGCU C-Taq热启动酶)
三、微变异
1、定义
含有某种序列变异的等位基因被称为微变异，因为它们与完全重复的等位基因仅有细微的差别。
例TH01：9.3的重复区包括9个完全重复单位（AATG）和一个三核苷酸的不完全重复的时候，丢失了一个碱基。等位基因9.3和10的区别是在第七个重复单位有一个腺嘌呤碱基的缺失。
AATG—AATG—AATG—……AATG—AATG— AATG—AATG—AATG
2、确认微变异
1）先确定该OL峰并非扩增或电泳引起的杂峰
2）使用其他试剂盒重新验证
3）有条件可以做测序验证
4）与已报道过的微变异进行比较并记录在案www.v/strbase/var_tab.htm
补充：稀有等位基因
1、稀有等位基因的相关概念：
① 稀有等位基因与常见的等位基因相差一个或一个以上的碱基
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