秀珍菇退化菌株生物学特征比较及dsRNA病毒检测
秀珍菇退化菌株生物学特征比较及dsRNA病毒检测
作者：柯斌榕 卢政辉 吴小平 陈发川 兰清秀
来源：《南方农业学报》2018年第01期
        摘要：【目的】比较秀珍菇退化菌株与正常菌株的生物学特征并进行双链RNA（dsRNA）病毒检测，为秀珍菇栽培过程中选择优质菌种提供参考依据。【方法】开展秀珍菇退化菌株菌丝拮抗、菌丝生长速度及出菇试验，与正常菌株进行生物学特征比较，通过ITS扩增，利用RAPD、ISSR和SRAP分子标记分别进行差异性比较，并开展dsRNA病毒检测，分析秀珍菇菌株的退化原因。【结果】秀珍菇退化菌株X9和X13与正常菌株X5、X6及对照菌株X15间存在拮抗反应，当培养基的pH低于5.0时，退化菌株的菌丝生长速度显著降低（P
        关键词：秀珍菇；栽培；退化菌株；dsRNA病毒检测
        0引言
        【研究意义】秀珍菇学名肺形侧耳（Pleurotuspulmonarius），隶属于真菌门担子菌纲伞菌目侧耳菌科侧耳属，最早由我国台湾地区引进，目前已在福建、浙江及上海等地广泛栽培（林原等，2015），其子实体形态纤小优美，质地细腻，鲜美可口，且出菇期在夏季，有利于缓解市场鲜菇紧缺状况。我国主栽的秀珍菇品种亲缘关系十分接近，经多年组织扩繁后易出现菌种退化和老化现象，制约其产业的健康发展（卢政辉，2008凤尾菇栽培技术）。双链RNA（dsRNA）病毒在食用菌中广泛存在，有研究表明双孢蘑菇法国病与9个dsRNA片段有关（Morten and Hicks，1992）。本课题组前期研究发现退化的秀珍菇菌株中存在与正常菌株不同的dsRNA片段，但目前有关dsRNA病毒致使秀珍菇菌株退化的具體机理尚不清楚。因此，开展秀珍菇退化菌株生物学特征研究及dsRNA病毒检测，对选择秀珍菇生产用种具有重要指导意义。【前人研究进展】菌种退化现象在食用菌栽培中普遍存在，如蛹虫草栽培中菌种退化问题是困扰其产业发展的关键（林清泉等，2010），双孢蘑菇菌种退化导致基质降解能力下降，影响其栽培质量（陈美元等2011）。引起菌种退化的原因较多，如病毒感染（Magae and Hayashi，1999）、长期转管传代引起碱基错配及交配型因子变异或保藏环境不适宜导致突变等（丁湖广，2006；李丹青和王杰，2015）。Krzysz-tof（2010）研究表明，
双孢蘑菇褐病变及减产与蘑菇病毒x等有关。此外，Qiu等（2010）报道从退化的平菇天达300中提取到4个dsRNA片段。【本研究切入点】目前，针对秀珍菇菌种退化现象及原因的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】分离、观察秀珍菇生产中易感染木霉和黄菇病的退化菌株，通过与正常生产用种进行生物学特征比较，并进行dsRNA病毒检测，以期从中出性状差异，为选择优质秀珍菇菌种用于生产提供参考依据。
        1材料与方法
        1.1试验材料
        供试菌株来源：X9和X13退化菌株为本课题组从秀珍菇感病、低产菌包中分离获得，X5和X6菌株为本课题组从正常出菇秀珍菇菌包中分离获得，对照菌株X15由福建农林大学菌物研究中心保藏提供，平菇47菌株为平菇天达300退化菌株引至河南农业大学生命科学学院微生物实验室，作为dsRNA检测对照菌株。感染木霉和黄菇病的秀珍菇见图1。
        供试培养基为马铃薯琼脂培养基（PDA）：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，水1.0L，pH自然。栽培料配方：木屑75%，棉籽壳12%，麸皮12%，石灰1%，水含量65%。
        1.2试验方法
        1.2.1菌落形态比较及拮抗试验将秀珍菇菌株活化后，接种于含PDA培养基的90 mm平皿中，倒扣置于25℃培养箱中培养，待菌丝接近长满时，观察菌落形态。同时将X5、X6、X9、X13和X15菌株进行活化，接种于同一个含PDA培养基的培养皿中，菌种间相距约3 cm，呈三角形排列，并对所有菌株进行两两拮抗处理，每处理3次重复。置于25℃恒温箱中培养，观察拮抗现象。
        1.2.2温度及pH对菌丝生长速度影响观测
        接种于PDA培养基后，分别置于15、20、25、30和35℃培养箱中培养（每个温度梯度设5个重复），观察菌丝生长情况。采用PDA培养基，分别调整pH为4、5、6、7和8，每个pH梯度设5个重复，接种活化秀珍菇菌株后25℃恒温培养。当生长速度最快的菌丝长满培养基时，在菌落边缘划终止线。用直尺测量起始线与终止线的距离，计算各菌株在各温度及pH下菌丝生长速度的平均值。
        1.2.3出菇试验按栽培料配方配置、搅拌、装袋后，将菌包高压灭菌2 h，冷却接种活化
秀珍菇菌株后置于菇房中室温培养，每处理30个菌包，并记录菌丝在栽培料中的生长速度，菌丝满袋后再后熟培养15 d。从各处理中随机挑出一半菌包置于8℃菇房，低温刺激10 h后进行室温出菇管理（低温刺激出菇），另一半菌包不进行低温刺激直接进行室温出菇管理（常温出菇）。出菇管理按常规方式进行，统计菌包的污染率及产量。
        1.2.4ITS扩增及遗传差异性分析取1.0 g菌丝放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7 mL离心管中，采用CTAB法提取DNA，-20℃保存备用，具体操作及ITS-PCR参考郑秋霞等（201 5）的方法。采用RPAD、SRAP和ISSR进行遗传差异性分析，经初步筛选选用如下引物：RAPD引物（S26、S29、S30、S32、S36、S38、S40、S47、S48和S78）；ISSR引物（1、2、3、7、10、13、15、18、19和20）；SRAP引物（em5-me9、em9-me5、em9-me7、em4-me5、em4-me7、em4-me9、em5-me5、em5-me7和em9-me9），上述引物均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，具体操作参考江玉姬等（2013）的方法。
        1.2.5 dsRNA病毒感染检测利用dsRNA在15%无水乙醇条件下能吸附于纤维素粉的特性，通过特异地吸附、洗脱去除杂质，进行纯化，后续操作则参考王丽等（2009）的方法。
        1.3统计分析
        采用DPS v7.05对不同菌株间菌丝生长速度及出菇产量等试验数据进行方差分析。
        2结果与分析
        2.1秀珍菇的菌落形态观察及拮抗反应
        从图2可看出，不同秀珍菇菌株菌落形态差异不明显，但X13菌株的菌丝密度较其他菌株稀疏。由表1可知，对照菌株X15与正常秀珍菇菌株间无拮抗反应发生，而退化菌株X9和X13与正常菌株在拮抗试验中表现出拮抗反应。虽然退化秀珍菇菌株与正常菌株均源于同一种菌株，但经生产过程中的重复转代扩接及组织分离，菌株间可能已出现变异，从而产生拮抗反应。
        2.2温度及oH对秀珍菇菌丝生长的影响
        从图3和图4可看出，各菌株的菌丝均在25～30℃及oH 7-8时生长最快，但X9和X13菌株的菌丝生长速度显著低于其他菌株（P

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