解读感染性疾病诊断中POCT应用的进展
纳米技术在现实生活中的应用解读感染性疾病诊断中POCT应用的进展
感染性疾病的快速诊断是当前POCT技术应用的热点，比起传统病原学检测方法，POCT在诊断上更加快速和灵敏。目前，新兴的分子诊断技术满足了POCT检测速度，低成本的特点，在新冠疫情下分子POCT价值凸显。
POCT分子检测方法缩短样本检测时间，并能保证高特异性和敏感性，在现有基础上开发出针对各种感染性疾病的诊断试剂和仪器，仍将是POCT技术的开发重点。
随着分析技术融入更多的先进科技，POCT正朝着互联网整合模式发展，逐渐实现智能化、共享化、云端化，从而推动远程医疗的发展，实现个性化的服务。
1995年美国CLSI提出即时检测（point-of-care testing，POCT）的概念，1995年美国临床化学学会（AACC）年会展览展出了一些能够快捷移动、操作简便、结果准确可靠的技术和设备，即'在靠近患者的地方在极短的时间内以混合型实验室的形式获得准确测量结果的装置与仪器'，即POCT设备。POCT也可以被解释为靠近患者的床旁检测，医生、护士甚至患者都可以操作，快速的现场检测避免了标本采集送检的过多流程，缩短了发现传染病的时间，促进药物早期合理使用，从而实现传染病的早期防治目标。
一、POCT的发展POCT具有操作简便、便携、智能化等优点，近年来作为体外诊断技术发展迅速，被应用在多个学科的检测项目中。在感染性疾病检测中，POCT也已经成为十分重要的检测技术，检测项目广泛，除了常见的CRP、降钙素原、白介素-6等细胞因子的快速检测，还包括各种细菌、病毒等多种病原微生物的检测。随着生物医学技术的发展，干化学技术、免疫层析技术、谱、光谱、生物传感器及光电分析技术、计算机芯片技术、自动化技术等的应用以及免疫和分子生物技术的引进，POCT呈现出自动化和简单化的趋势，在临床和社区医疗中发挥着重要的作用。POCT所应用的技术原理正在从传统的干化学技术、免疫层析技术等向生物传感技术、微流控芯片技术等发展。二、POCT技术在感染性疾病诊断的应用（一）免疫学检测POCT应用的免疫学技术主要是胶体金免疫层析技术、免疫荧光技术、（电）化学技术、乳胶标记技术等，主要应用于病原体的抗原和抗体检测，病原体刺激机体产生细胞因子的检测，快速时相反应蛋白检测和代谢产物毒素检测等。
1．胶体金技术在病原体抗原抗体检测中的应用：目前在临床检测中最常见的是胶体金检测。胶体金免疫层析技术是以免疫层析技术、胶体金标记技术相结合的一种新型免疫学技术，其特点是单份测定、简单快速，几分钟即可用肉眼观察结果。该方法的优点是简单、快速、及时，缺点是灵敏度低，容易漏检。胶体金法能够直接检测传染病病原的抗原和抗体。
临床应用较广的POCT抗原检测包括：甲乙型流感抗原、呼吸道合胞病毒抗原（鼻咽部分泌物）、军团菌抗原（尿）、隐球菌抗原、恶性疟原虫循环抗原和间日疟原虫抗原、班氏丝虫抗原及利什曼原虫抗原的检测等。POCT抗体检测包括术前筛查项目[艾滋病病毒抗体（1+2）、梅毒螺旋体抗体、乙肝五项、丙肝抗体、乙型肝炎病毒表面抗原]，肾综合征出血热病毒抗体、乙型脑炎血清特异性抗体、单纯疱疹病毒抗体、人巨细胞病毒IgM抗体、风疹病毒抗体、轮状病毒抗体（粪便）、登革热病毒抗体、淋球菌（分泌物）和泌尿生殖系沙眼衣原体（分泌物）、沙门菌血清抗体、抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A抗体等，还能够检测弓形虫抗体、包虫体抗体、血吸虫抗体、人囊虫病等。2．胶体金法在感染性疾病炎性指标中的应用：急性感染时胶体金法检测CRP、降钙素原、血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A protein，SAA）、白介素-6等。在诊断细菌或病毒感染时更加简便快速，能够满足临床即时检测需求。SAA是细菌和病毒感染密切相关的标志物，其在判断感染特别是病毒感染方面明显优于CRP和WBC，可作为早期感染的判别标志物。病毒感染后，SAA上升的幅度与病毒种类有关，SAA联合CRP和WBC检测能够提高细菌或病毒感染诊断的可靠性。3．其他POCT技术在感染性疾病免疫学检测中的应用：免疫荧光技术分为直接免疫荧光和间接免疫荧光技术两类，主要应用于呼吸道病原体的抗原和抗体检测，其优点是直接在荧光显微镜下
看到病原体，缺点是检测时间长，需要荧光显微镜，要求人员有一定的形态学辨识能力。电化学技术应用于POCT病原体检测，优点是检测病原体项目多（弓形虫抗体、风疹病毒抗体、巨细胞病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体等），灵敏度高。缺点是特殊人假阳性率高（孕妇）。乳胶标记技术主要应用于病原体的抗原和抗体检测，例如狂犬病、日本乙型脑炎、隐球菌抗原等，其优点是快速，缺点是假阳性率高，容易发生非特异反应。（二）病原体核酸检测1．微流控芯片技术：1990年微型全分析系统（miniaturized total analysis system，μTAS）的概念提出之后，微流控芯片是μTAS中当前最活跃的领域和发展前沿，它将分析实验室功能转移到芯片上，即芯片实验室（lab-on-a-chip，LOC）。微流控芯片技术可将化学和生物等领域中涉及的样品制备、反应、分析、检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米的芯上，具有试剂样品用量少、分析速度快的优点，用于床旁检验已受到广泛关注。微流控芯片将核酸提取、扩增以及检测整合到微流控芯片上，降低了检测的复杂性，是目前绝大多数核酸POCT所采用的技术平台。微流控芯片在病原体检测的应用，临床采用Roche Cobas Liat系统，检测包括A/B型流感、A链球菌和A/B型流感加呼吸道合胞病毒，只需要15~20 min。利用微流控芯片扩增EB病毒，仅需0.5 μl样品，反应体积仅需1 μl，灵敏度为3×105拷贝/ml。Cooper等实现了白念珠菌的快速分离检测，相对于传统的微生物真菌培养需要几
天的时间鉴定，该检测仅需3 h就可检出血液中低至1个/ml的病原菌，使感染者能够及时得到恰当的救治，提高患者生存率，希望随着技术的改进，继续缩短检测时间。检测HIV病毒，每张微流控芯片可同时检测7份样本，整个检测过程在20 min内完成，且准确率达100%。微流控芯片技术不仅检测速度快，而且操作简单，将含蜡样芽胞杆菌的标本加入微流控芯片后，装置自动完成整个检测流程，检测灵敏度为细胞103~104个/ml。感染性疾病的分子诊断相对于细菌培养方法，在灵敏度、快速等方面均有显著优势，目前微流控生物传感器对感染性疾病的检测已实现了多样品来源如唾液、口腔上皮细胞、血浆等，检测种类涵盖多种细菌、真菌、病毒检测。Oblath等将除核酸提取步骤外的一整套检测流程整合到微流控芯片上，并利用氧化铝薄膜为实时PCR扩增过程提供温度循环条件，实现唾液中多种口腔链球菌的分型检测，快速准确，检测灵敏度为8~12拷贝/μl。Cepheid公司的Xpert检测耐甲氧西林金黄葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）对比常规细菌培养方法，大大地缩短了阴性结果的周转时间，灵敏度和特异度都大大提高。Xpert MTB/RIF可以直接从原始痰标本中快速、敏感地检出结核分枝杆菌及利福平耐药性。WHO认可并推荐Xpert MTB/RIF在结核病防治规划中的应用。在非洲进行的一项多中心、随机、对照试验评估了Xpert MTB/RIF即时检验对结核病的可行性、准确性和临床疗效，结果显示Xpert MTB/
RIF可以在初级保健机构由护士准确操作，由此可使更多的患者当天就开始，以缩短开始的时间。核酸检测的微流控芯片也在朝着高通量方向发展，一次检测可以完成多种微生物鉴定、多种药物敏感基因的分型。基于微流控技术实现人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）基因分型，能检测和识别17个HPV高危型和7个HPV低危型。检测限103拷贝数/L，某些型别甚至更低。法国梅里埃Filmarray检测平台，能够在单次反应中对多种病原体核酸进行检测，具有很高的灵敏度和特异度，帮助医生对患者感染及早诊断和正确用药。该产品目前具有上呼吸道感染（19种病毒和3种细菌）、胃肠道感染（13种细菌、5种病毒和4种寄生虫）和脑膜炎/脑炎（6种细菌、7种病毒和1种真菌）等多种病原检测试剂盒。2．微流控芯片联合等温扩增技术：将核酸扩增与微流控芯片技术联用开展POCT检测，但是如果现场检测仪器不具备温控系统则很难应用于POCT检测，而整合环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）可在恒温条件下实现快速扩增，操作简便快捷，更便于现场使用。在DNA病毒检测方面，Cai等采用逆转录LAMP检测乙肝病毒，并采用常规分子生物学方法评价该法性能，检出限为210 IU/ml。在RNA病毒检测方面，Kurosaki等建立了逆转录LAMP法检测马尔堡病毒，灵敏度可达102拷贝/μl，该法可在40 min内检测出马尔堡病毒。Kurosaki等建立的针对扎伊尔型埃博拉病毒的检测逆转录LAMP方法，
在26 min内即可检测出20拷贝/μl的扎伊尔型埃博拉病毒，同时特异性较高，与亲缘性较近的病毒核酸序列（如苏丹型埃博拉和马尔堡病毒等）没有交叉反应。在细菌检测方面，采用LAMP技术检测结核分枝杆菌的试剂盒面市，该试剂盒检测阳性痰液中结核菌的灵敏度为98.2%，直接检测阳性患者的诊断灵敏度为88.2%，整个检测过程在1 h内完成，并且操作简便，为基层POCT检测提供了方便。因此整合LAMP和微流控技术，以可控流体贯穿反应过程，将多个操作平台集成在一张芯片上，具有集成化和微型化的优势。Alere流感A/B测试使用等温扩增和分子信标探针技术，5 min完成鼻拭子标本的流感病毒A/B检测。基于微流控等温扩增技术的甲型H1N1流感病毒检测，反应体系3 μl，可在30 min内完成检测，最低检测限可达10拷贝/μl。Ma等设计了一个集成、自驱动的微流控芯片用于数字LAMP反应，整个检测过程可以通过毛细作用力在芯片上自动完成，30 min对耐万古霉素肠球菌菌株特异性基因进行扩增，检测限仅为11个拷贝/μl。3．纳米孔测序技术：纳米孔测序技术也被公认为未来测序发展的一大方向。与以往的测序技术皆有不同，它不是通过检测光、荧光信号颜或pH来实现碱基序列的读取，而是基于电信号的测序技术。蛋白质纳米孔（微型的小孔，其本质是在膜上形成通道）被嵌入在合成膜上，并浸没在电生理溶液中，使离子电流通过纳米孔。在像DNA或RNA这样的分子通过纳米孔时，会对电流带来干扰，引起电流信号的特征性
改变。在此过程中，信号被实时分析，用来确定正在通过该孔的DNA或RNA链的碱基序列。纳米孔会分析通过它的整个DNA或RNA片段。因此，在纳米孔测序中，读长长度与制备样本中DNA或RNA的长度一致。用户可以根据他们想要的实验结果来选择恰当的样品制备方法，生成最适合的读长长度。目前，使用标准的DNA提取方法已能够获得数万到数十万碱基的读长，而由纳米孔社区用户设计的温和提取法已获得了超过2 000 000 bp的读长。纳米孔技术提供的是动态、实时的测序，支持在几分钟内就获得病原体鉴定等时间关键型应用的检测结果。用户可以在测序早期了解样本的质量和状态，也可以在获得足够的数据后停止测序。未来，快速的采样到结果周转时间在感染性疾病、实地动态监测疫情暴发以及其他诊断方面具有巨大潜力。Kafetzopoulou等报道拉沙热暴发，纳米孔测序仪对36个基因组测序，拉沙热病毒与前一年病原体存在系统发育混交，表明存在独立的人畜共患的风险。三、POCT技术在感染性疾病诊断应用中的局限性

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。